陈琳珊 陈佩佩 何雯倩 陈茹
摘 要:建立了高效液相色谱-串联质谱法对养殖鱼中的乙氧基喹啉进行快速测定。基于QuEChERS技术,样品用乙腈和水提取,盐析分层离心。经增强型基质去除固相吸附剂(Enhanced Matrix Removal,EMR)净化后,通过电喷雾电离源(Electrospray Source Ionization,ESI)的正离子模式电离,结合多反应监测(Multiple Response Monitoring,MRM)进行采集。乙氧基喹啉标准曲线在1.0~200 μg/L范围内呈良好线性关系,相关系数r>0.999 6,平均回收率为82.9%~105.0%,方法检出限为10.0 μg/kg,方法定量限为30.0 μg/kg,相对标准偏差RSDs为4.64%~5.96%。该方法简单快捷,回收率良好、灵敏度高和重现性好,可应用于实际养殖鱼中乙氧基喹啉的快速测定。
关键词:超高效液相色谱-串联质谱法;快速测定;水产品;乙氧基喹啉
乙氧基喹啉(Ethoxyquin,EQ)是一种经化学合成的芳香胺,结构如图1所示,呈油状液体,具有清除自由基从而防止脂质氧化的作用,同时对蛋白质、维生素等物质也有很好的抗氧化效果[1],因此在饲料产品市场中应用广泛。有研究表明,一定量的乙氧基喹啉对大黄鱼、雏鸡具有一定的促生长作用,但过量时会产生抑制生长的作用[2-3],同时,过量的乙氧基喹啉会对动物机体产生一定的不良影响,如400 mg/kg
的饲料添加量会使大菱鲆降低食量[4],而15 000 mg/kg的添加量也会使大西洋鲑产生拒食现象[5]。按照欧盟规定,2018年3月31日后不允许饲料产品中有乙氧基喹啉产品添加,可见乙氧基喹啉的安全性确实存在一定的争议,而人类作为水产品的终端消费者,乙氧基喹啉在水产品中的残留量也会对人体存在一定的隐患。目前,我国的相关法律法规仍然允许乙氧基喹啉在饲料中添加使用,由于其效果优异,即使我国水产品行业禁用后,仍然有可能会存在一段时间的违法滥用。因此,建立水产品中乙氧基喹啉快速有效的检测方法具有极其重要的意义。
图1 乙氧基喹啉化学结构式
目前,对水产品中乙氧基喹啉测定方法的相关报道较少,主要为毛细管电泳法[6]、高效液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10]、液相色谱串联质谱法[11]、气相色谱-质谱法[12]和高分辨质谱法[13]。毛细管电泳法灵敏度高、重现性差,高效液相色谱法和气相色谱法则存在选择性较低的问题,高分辨质谱法价格昂贵,仪器维护成本高,难以普及,因此这些方法均难以应用于实际的大批量检测。而液相色谱串联质谱法、气相色谱-质谱法则具有灵敏度高,选择性好,应用广泛的优点,可用于实际的批量检测。本文建立的高效液相色谱-串联质谱法,基于QuEChERS方法提取,增强型基质去除净化剂EMR进行净化,通过二次优化质谱参数,使目标物达到实际测定的最佳响应值,结合高效液相色谱,使目标物在短时间内出峰,且保持良好的峰型。同时方法学实验数据表明,该方法可有效测定水产品中的乙氧基喹啉。
1 材料与试剂
1.1 仪器与设备
高效液相色谱-质谱/质谱联用仪,配有电喷雾电离源(ESI)(API 4000Q,AB SCIEX公司);电子天平;4k-15离心机(北京卓明贸易有限公司);IKA Vortex4涡旋混匀器(广州仪科实验室技术有限公司);Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。
1.2 材料与试剂
养殖鱼样品,购于广州市市场。
甲酸、乙腈(LC-MS级,美国Thermo Fisher公司);乙氧基喹啉标准品(纯度≥98.5%,SIGMA,购自安谱公司);EMR净化管(安捷伦,购自德祥公司);石墨化炭黑键合硅胶(Graphitizing of Carbon Black,GCB)、十八烷基键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺键合硅胶(Primary Secondary Amine,PSA)(购自广州联方公司);无水硫酸镁、氯化钠(分析纯,购自安谱公司)。
1.3 实验条件
1.3.1 标准溶液的配制
标准溶液:称取适量标准品,用乙腈溶解并配成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液,于4 ℃下避光保存。
标准工作溶液:分别准确移取一定体积的标准储备液,用乙腈重新定容成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L的标准工作液。
1.3.2 样品处理
养殖鱼产品先均质处理。称取均质后样品2.0 g(精确至0.01 g),精密称定于50 mL离心管中,先加入水10 mL,再加入乙腈10 mL,涡旋混合2 min,然后加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠,涡旋提取15 min,10 000 r/min离心5 min,离心后取2 mL上清液转移至15 mL EMR脱脂净化管(预先用1 mL水活化2 min)中,涡旋2 min后,4 500 r/min离心5 min,取1.5 mL上清液于装有0.5 g无水硫酸镁的2 mL离心管中脱水后过膜上机。
1.3.3 色谱条件
色谱柱:Agilent poroshell EC-C18 (150 mm×3.0 mm,2.7 μm);柱溫为40 ℃;进样量为10 μL;流动相A为乙腈,B为0.1%甲酸水(体积分数);采用等度洗脱方式洗脱分离:A∶B为80∶20;流速为0.40 mL/min;采集时间:7 min。
1.3.4 质谱条件
离子源:电喷雾电离源(ESI);电离模式:正离子模式;离子源温度为500 ℃,离子源电压为5 000 V。雾化气(GAS1):50 psi;加热辅助气(GAS2):50 psi;碰撞气(CAD):medium;采集模式:多反应监测(MRM)模式。
2 结果与分析
2.1 质谱分析条件的确定
建立养殖鱼中乙氧基喹啉的仪器分析方法,通过流动注射的方式,将标准溶液直接注入ESI离子源,确定乙氧基喹啉的母离子质荷比为m/z 218.3,子离子质荷比分别为m/z 148.2和m/z 174.2,同时优化其去簇电压DP和碰撞能量CE,得到最佳的参数条件,见表1。通过优化色谱条件,确定最佳洗脱流动相比例为乙腈∶0.1%甲酸水(80∶20),流速为0.40 mL/min。乙氧基喹啉标准品提取离子流色谱图如图2所示。
2.2 分散固相萃取剂类型的选择
在实验初期,探究了分散固相萃取剂类型对乙氧基喹啉回收率的影响。由于购买的EMR净化管中包含了1.1 g的EMR净化粉末,为了保证方法的简便性,不再对用量进行探究,同时,用同样量的PSA、C18和GCB净化粉末进行回收率的对比。分别对每个用量水平重复测定6次,以平均回收率为考察依据。结果显示,当用EMR净化时,乙氧基喹啉的回收率最高。而且水产品中含有较多的油脂,用EMR净化能降低仪器分析时的基质效应。因此,最终选择EMR为净化剂。结果详见图3。
2.3 基质效应
养殖鱼中基质复杂,对目标物可能存在基质效应,从而影响目标物在质谱中的离子化程度,因此对乙氧基喹啉的基质效应(matrix effect,ME)进行了考察。按照前处理方法对乙氧基喹啉呈阴性的罗非鱼进行处理,得到空白基质液,用此空白基质液配制50 μg/L的单标溶液,按方法的仪器条件测试,测得值和原浓度比值即为ME,以ME作為判断的依据。当ME值在0.8~1.2时,基质效应不明显;若ME值小于0.8,则说明基质效应为强负效应明显,大于1.2则为强正效应。乙氧基喹啉的ME计算结果为0.92,说明基质效应不明显,这可能是由于EMR净化了样品中大部分的油脂。因此,为了简化实验,最终采用溶剂曲线作为定量曲线。
2.4 线性关系和检出限
在本方法所确定的实验条件下,用乙腈将标准溶液稀释至1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L进行测定,以峰面积(Y轴)对相应的浓度(X轴)作图,得到线性方程Y=1.76×104X-3.92×103。结果表明,待测化合物浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系,相关系数r为0.999 6,具有较准确定量能力。
同时,通过对罗非鱼样品进行低浓度水平加标,再分别按信噪比的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10),得出方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果表明,乙氧基喹啉的方法检出限为10.0 μg/kg,定量限为30.0 μg/kg,表明方法具有较高的灵敏度。
2.5 回收率与精密度实验
选取均质后的样品初步平均测定3次,确定其本底值,再进行加标回收实验,结果见表3。最终选用乙氧基喹啉呈阴性的罗非鱼和黄鳝作为加标回收样品,按照乙氧基喹啉定量限的1倍、2倍和5倍水平进行添加,每一个水平均进行日内重复测定6次(n=6)。最终测得平均回收率在82.9%~105%,相对标准偏差RSD为4.64%~5.96%。结果表明,方法回收率良好,精密度好,满足实验室的测定要求。
3 结论
本文基于QuEChERS技术对样品进行提取,选用增强型基质去除EMR粉末进行分散固相萃取净化。建立的超高效液相色谱条件使目标物在3 min内出峰,且峰型良好。通过流动注射混合流动相的方式,二次优化目标物的质谱参数,提高了目标物的灵敏度。通过方法学实验验证了方法的可行性,结果表明,该方法回收率良好,灵敏度高,重复性好。在实际的样品测定实验中,能有效检测出实际阳性样品,因此,可应用于日常实验室的检测中,同时也为后续的相关研究提供了参考依据。
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