柴胡皂苷A上调HO-1对新生大鼠神经OGD/R损伤的影响

何 静，王珏岚，邹福兰，梁小明，陈 燕

1)四川省医学科学院；四川省人民医院儿科 成都 610031 2)四川省医学科学院；四川省人民医院肿瘤科 成都 610031 3)四川省医学科学院；四川省人民医院门诊儿科 成都 610031

缺血缺氧性脑病是新生儿死亡和不可逆脑损伤的主要病因[1]。低温治疗等干预手段已大大改善了缺血缺氧性脑病新生儿的结局，但是，仍有大量新生儿死亡或遭受严重的脑损伤。缺血/缺氧和再灌注/复氧会引发自由基的产生，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、过氧化氢和其他羟基自由基[2]，而自由基引起的炎症和氧化应激反应可导致神经细胞坏死和凋亡[3]。柴胡皂苷A(saikosaponin A，SSa)可以通过抑制核因子κB等抑制炎症和氧化应激反应[4]。SSa也可浓度依赖地上调核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)和其靶分子血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)，缓解小鼠子宫内膜癌症状[5]。本研究中，我们分离了新生大鼠海马神经细胞建立体外氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型，观察SSa对海马神经细胞氧化应激及凋亡相关蛋白表达的影响，以探索SSa在脑缺血缺氧损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养新生SD大鼠(出生2 d内，由四川省实验动物研究所实验动物中心提供)断头，分离海马神经细胞，在2.5 g/L胰蛋白酶(美国Sigma公司)中于37 ℃轻轻摇动消化20 min。将细胞悬浮于DMEM培养基(美国HyClone公司)中，该培养基含有体积分数10%胎牛血清、体积分数10%马血清、10 g/L L-谷氨酰胺(均购自美国Gibco公司)和100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素(美国HyClone公司)。细胞接种在15 mm共聚焦皿上，每皿5×105个，该皿用0.1 g/L聚D-赖氨酸(美国Sigma公司)包被。2 h后，用含有体积分数2%神经细胞培养补充剂B27(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素和2.5 g/L谷氨酰胺的神经基础培养基代替共聚焦皿的培养基。之后，每4 d更换1 mL培养基[6]。

1.2 实验分组及处理实验Ⅰ：分为OGD/R组、OGD/R+SSa 2.5 mol/L组、OGD/R+SSa 5.0 mol/L组、OGD/R+SSa 10.0 mol/L组，另设未经OGD/R和加药处理的细胞作为对照组。实验Ⅱ：细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+SSa 5 mol/L组以及OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385(Nrf2信号通路抑制剂)2 mol/L组。OGD/R:海马神经细胞在厌氧室(体积分数1%CO2、5%CO2、94%N2孵育)、不含葡萄糖的DMEM培养基(美国HyClone公司)中于37 ℃孵育12 h，以模仿缺血缺氧；此后，在常氧条件、正常培养基中孵育24 h，以确保复氧[7]。对于除CCK-8实验以外的给药处理，按1×106个/孔将细胞接种于6孔板，分别于缺氧前2 h和复氧后给药，复氧给药后24 h检测各指标。其中，SSa(纯度≥98%；货号Y0001932)和ML385(纯度≥98%；货号SML1833)购自美国Sigma公司。

1.3 海马神经细胞活力的测定CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。将海马神经细胞以5×103个/孔的密度接种在含100 μL培养基的96孔板中，12 h后OGD/R组行OGD/R处理，不经OGD/R处理的更换50 μL正常培养基。于接种后的第48 h分别更换含1 μL PBS的50 μL培养基或SSa，在37 ℃孵育22 h。将10 μL CCK-8溶液添加到培养物中，并在37 ℃孵育2 h。使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)在450 nm波长下测光密度值，以背景校正后的处理组与对照组的百分比计算细胞活力。实验重复6次。

1.4 海马神经细胞ROS水平的测定使用探针2,7-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA；南京建成生物工程研究所)，根据说明书测量细胞内ROS水平。将经1.2所述处理的各组细胞与10 μmol/L DCFH-DA在黑暗中于37 ℃孵育30 min。然后，将细胞重悬于500 μL PBS中，并置于FACS Calibur流式细胞仪中，设置488 nm激发和521 nm发射波长，测量荧光强度。实验重复3次。

1.5 海马神经细胞MDA水平的测定将各组海马神经细胞在PBS(pH=7.4)中匀浆，然后在4 ℃下以3 000×g离心5 min。取上清液使用MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定MDA的水平。实验重复3次。

1.6 海马神经细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Nrf2和HO-1等凋亡和氧化应激相关蛋白的测定使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取核蛋白和细胞质。使用BCA蛋白质检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)对细胞质和核提取物中的蛋白质浓度进行定量。将等量的蛋白质样品(每泳道30 μg)通过100 g/L SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶中封闭1 h。将膜与Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Nrf2、HO-1、Iamin B1(内参)、GAPDH(内参)一抗孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Abcam公司)孵育。最后，使用ECL检测试剂(德国GE Healthcare公司)将膜上的蛋白条带可视化，并通过Image J测定条带的灰度值，目的蛋白相对表达量取目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。实验重复3次。

1.7 统计学处理采用GraphPad Prism 6分析结果。各组间细胞活力、ROS、MDA、Bax/Bcl-2、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2和HO-1水平等的比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞活力的比较与对照组比较，其他4组细胞活力降低；与OGD/R组比较，2.5、5.0和10.0 mol/L SSa与OGD/R共处理组细胞活力升高(表1)。

表1 各组细胞活力的比较 %

2.2 各组细胞凋亡和氧化应激相关指标的测定结果与对照组比较，其他4组Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高，MDA和ROS上升；而与OGD/R组比较，2.5、5.0和10.0 mol/L SSa与OGD/R共处理组上述指标均降低(图1、表2)。

1：对照组；2：OGD/R组；3：OGD/R+SSa 2.5 mol/L组；4：OGD/R+SSa 5.0 mol/L组；5：OGD/R+SSa 10.0 mol/L组

2.3 各组细胞中Nrf2、HO-1蛋白的检测结果与对照组比较，其他4组Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高；与OGD/R组比较，5.0、10.0 μmol/L SSa与OGD/R共处理组Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高(图2、表3)。

1：对照组；2：OGD/R组；3：OGD/R+SSa 2.5 mol/L组；4：OGD/R+SSa 5.0 mol/L组；5：OGD/R+SSa 10.0 mol/L组

表3 各组细胞Nrf2和HO-1蛋白表达的比较

2.4 各组细胞活力、ROS、MDA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2的检测结果与对照组比较，OGD/R组细胞活力下降，ROS、MDA、Nrf2、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高；与OGD/R组比较，OGD/R+SSa 5 mol/L组细胞活力升高，ROS和MDA降低，Nrf2进一步升高，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3降低；与OGD/R+SSa 5 mol/L组比较，OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385 2 mol/L组细胞活力下降，ROS和MDA升高，Nrf2表达下降，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高(图3、表4)。

1：对照组；2：OGD/R组；3：OGD/R+SSa 5 mol/L组；4：OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385 2 mol/L组

表4 4组细胞活力、ROS、MDA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2的比较

3 讨论

氧化应激以及其导致的神经细胞坏死和凋亡是缺血缺氧性脑病的关键致病机制。缺血缺氧发生后，氧化应激被诱导，短时间内就可能导致细胞坏死，并启动持续的炎症、氧化应激和凋亡，相互促进，造成不可逆的神经损伤[8]。尽管已经有各种治疗措施，但缺血缺氧导致的神经损伤依然是新生儿致残和致死的主要原因[9]。SSa具有抗氧化应激、抗炎和抗凋亡的作用。在这项研究中我们发现，SSa可显著抑制OGD/R诱导的海马神经细胞氧化应激和细胞凋亡。潜在的机制与其对海马神经细胞Nrf2途径的调节作用有关。

在缺血缺氧性脑病中，氧化应激是最主要的病理刺激[1]。SSa具有激活Nrf2的功能，在烟草导致的小鼠肺炎模型中，SSa通过上调Nrf2/HO-1抑制氧化应激和炎症反应[9]。药动学研究[10]表明，SSa给药后在脑内的药物浓度高于血浆。因此，SSa可能对新生儿缺血缺氧性脑病中氧化应激反应具有抑制作用，尤其是通过Nrf2/HO-1通路。我们的结果表明，SSa可诱导OGD/R海马神经细胞Nrf2核蓄积以及HO-1的表达，而Nrf2信号逆转了SSa对OGD/R诱导的海马神经细胞损伤的保护作用。这些发现表明，SSa通过激活Nrf2信号对OGD/R诱导的海马神经细胞损伤具有保护作用。

凋亡持续是新生儿缺血缺氧性脑病导致不可逆神经损伤的根源，因此，抑制凋亡是治疗该病的重要途径[1]。柴胡皂苷D等类似物在肿瘤细胞中被发现具有促凋亡作用[11]；然而，在神经细胞中，柴胡皂苷类可能通过抑制糖皮质激素受体和调节Bax抑制凋亡[12]。此外，SSa也可能通过对氧化应激和炎症的调控，间接抑制凋亡。SSa通过多种途径抑制炎症，如在高血脂型胰腺炎中通过抑制NF-κB减轻炎症[4]。氧化应激和炎症反应均能诱导凋亡，从而导致缺血/再灌注损伤[8]。我们的结果表明，SSa可改善OGD/R引起的海马神经细胞活力降低。同时，SSa导致Cleaved-Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2比值降低，这表明SSa具有抗凋亡作用。

本文存在一些局限性。首先，整个实验并没有探索SSa对新生大鼠缺血缺氧的保护作用。其次，炎症的激活可能是氧化应激和凋亡持续的一个动因，而本研究对炎症的研究不足。因此，SSa对新生儿缺血缺氧性脑病的保护作用，还有待深入研究。

总之，SSa可通过激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制凋亡来保护海马神经细胞免受OGD/R损伤。