竹荪蛋多酚提取工艺及抗氧化活性*

朱 炜，俞婷婷，陈康康，计玮玮**，黄 玲，吴建明，沈晓利，刘 彬

（1.湖州市生态林业保护研究中心，浙江 湖州 313000；2.湖州市梁希森林公园管理处，浙江 湖州 313000;3.长兴县自然资源和规划局，浙江 长兴 313199）

竹荪（Dictyophora indusiata），又名竹笙、竹参，隶属于鬼笔目（Phallales） 鬼笔科（Phallaceae） 竹荪属（Dictyophora），外形优美，味道鲜美，营养丰富，在民间有“真菌皇后”之称[1-2]。竹荪可补气养阴、润肺止咳、清热利湿。其子实体中含有21种氨基酸及多种维生素，还富含多糖和多种微量元素，具有提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤等作用[3-4]。竹荪蛋即竹荪胚体，由近地面或地面的一支或数支菌索顶端扭结膨大而生长形成，是竹荪子实体的发育前期，由梦荪、菌盖、孢子、外包被等4部分构成[5-6]。多酚是一种具有多元酚羟基结构的次级代谢产物，主要经过丙二酸和莽草酸的途径合成[7]。多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，已被广泛用于开发预防口腔感染、降血糖、降血压、神经保护等产品中[8]。

目前关于竹荪蛋中活性成分的研究较少。本试验在单因素试验的结果讨论后，利用超声提取工艺，应用响应面法分析竹荪蛋多酚的提取工艺条件；并测定竹荪蛋多酚的抗氧化能力，为进一步保存和开发竹荪蛋资源提供理论支撑。

1 方法

1.1 材料试剂

竹荪蛋采自浙江省湖州市毛竹林中；没食子酸对照品，Sigma公司；维生素C，合肥博美生物科技有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma公司；其他试剂均为分析醇，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

超声波清洗器，购自昆山禾创超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，购自上海申生科技有限公司；UV-2600紫外分光光度计，购自日本岛津公司。DKZ-2型电热恒温振荡水槽，购自上海福玛实验设备有限公司；PL602-S电子天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；

1.3 试验方法

1.3.1 竹荪蛋多酚的提取

将竹荪蛋采集后真空烘干后粉碎，过40目筛，得到竹荪蛋粉末。将装有1 g竹荪蛋粉末的锥形瓶置于超声波清洗器中进行超声辅助提取，超声功率300W，按照料液比1∶25加入不同浓度的乙醇作为提取溶剂，按照不同的乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、超声时间（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min） 和超声温度 （30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）进行提取，提取完成后提取液在4 000 r·min-1下离心10 min，将上清液转入50 mL容量瓶定容，得样品溶液，用于后续测定含量。

1.3.2 提取条件的单因素试验

称取适量干燥粉碎后的竹荪蛋1 g，按照1.3.1中的提取方法，超声功率300 W，料液比1∶25。固定萃取温度为50℃条件下超声提取，分别在40%、50%、60%、70%、80%乙醇浓度条件下超声萃取30 min，考察乙醇浓度对竹荪蛋多酚得率的影响。固定乙醇浓度50%，分别在萃取温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下超声提取30 min，考察萃取温度对竹荪蛋多酚得率的影响。固定乙醇浓度50%，超声萃取温度50℃，分别超声萃取提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，考察超声时间对竹荪蛋多酚得率的影响，每个处理重复3次。

1.3.3 响应面法分析试验

选择超声时间、乙醇浓度、萃取温度3个因素的最佳水平，运用Box-Behnken组合试验设计，采用响应面设计方法，应用Design Expert 8.05软件对试验数据进行回归分析。试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面水平设计表Tab.1 Response surface level design table

1.3.4 多酚含量的测定

1）没食子酸标准曲线制作

称取没食子酸标准品100 mg，加蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶定容，得1.0 mg·mL-1没食子酸标准溶液备用。酒石酸亚铁溶液、pH为7.5的缓冲溶液[9]。

采用酒石酸亚铁法分别移取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 的 1.0 mg·mL-1没食子酸标准溶液，置于10 mL容量瓶中，补水至1 mL，加入酒石酸亚铁溶液3.0 mL，摇匀后以pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液定容混匀，于540 nm下测定其吸光度。以浓度C（μg·mL-1）为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线[10]。

2）多酚含量的测定

按照1.3.1中竹荪蛋多酚提取的方法，将样品溶液稀释50倍后即得待测液，取1 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照上述没食子酸标准品的方法测定待测液浓度，按照下式计算竹荪蛋中多酚得率（Q，mg·g-1）:

式中：ρ为待测液浓度（mg·mL-1）；n为提取液稀释因子；V为提取液体积（mL）；W为原料质量（g）。

1.3.5 竹荪蛋多酚抗氧化能力测定

各称取25 mg最优条件提取得到的竹荪蛋多酚及VC，加适量蒸馏水制成1 000 μg·mL-1溶液，并且分别稀释至 0、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1。

1） 对DPPH·清除能力的测定

参照李亚辉等[11]的方法，精确配制浓度为5 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液，分别精确吸取3 mL不同质量浓度的竹荪蛋多酚样品溶液，加入5 mLDPPH-乙醇溶液，混匀后在室温下静置30 min，以5 mL无水乙醇和3 mL蒸馏水的混合液为参比，测定517 nm波长处的吸光度，以VC为对照。样品对DPPH自由基清除率（R1，%） 计算为：

式中：A0表示只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1表示样品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2表示样品溶液的吸光度。

2）对超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力的测定

使用参考文献[12]的方法测定，4.5 mL pH 8.2 Tris-HCl缓冲液（0.05 mol·L-1）分别与0.5 mL不同质量浓度竹荪蛋多酚样品混合，于25℃水浴中预热20 min，加入0.5 mL 25 mmol·L-1邻苯三酚溶液。混匀后于25℃水浴中反应5 min后，加1 mL 8 mol·L-1HCl溶液终止反应10 min，后于420 nm波长处测定吸光度，以VC作对照。样品对超氧阴离子自由基清除率（R2，%） 计算为：

式中：A1为样品的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

3）羟基自由基清除能力测定

羟自由基清除能力测定采用Fenton反应体系[13]。在10 mL试管中加入2 mL FeSO4溶液（6 mmol·L-1）、2 mL H2O2溶液（6 mmol·L-1）、2 mL水杨酸（6 mmol·L-1）和2 mL不同质量浓度的竹荪蛋多酚样品，在37℃下反应1 h，在510 nm波长处测定其吸光度，以VC作对照。样品对羟自由基清除率（R3，%） 计算为：

式中：A0表示只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1表示样品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2表示溶液样品的吸光度。

1.3.6 数据处理

使用Design Expert 8.05软件分析和处理数据[14]。

2 结果

2.1 竹荪蛋多酚萃取工艺

2.1.1 单因素试验

1）乙醇提取浓度对竹荪蛋多酚提取含量的影响

乙醇提取浓度对竹荪蛋多酚提取含量的影响见图1。

图1 乙醇提取浓度对竹荪蛋多酚提取含量的影响结果统计Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由图1可知，随着乙醇浓度的逐渐升高，多酚得率呈上升趋势，并于60%时最高，随着乙醇浓度的增加，得率下降。原因可能是乙醇浓度的增加，脂溶性物质等其他杂质溶出也随之增多，从而阻碍了多酚的溶出[12]，因此选择乙醇浓度50%、60%、70%作为响应面分析的3个水平。

2） 超声时间对竹荪蛋多酚提取的影响

超声时间对竹荪蛋多酚提取含量的影响见图2。

图2 超声时间对竹荪蛋多酚提取含量的影响Fig.2 The effect of ultrasound time on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由图2可知，多酚得率先上升，后下降，45 min超声时间竹荪蛋多酚得率最高。原因可能是超声时间的延长，导致多酚类化合物的氧化分解，或多酚在超声波作用下部分降解损失，从而使多酚得率降低[15]。由此选择响应面分析的超声提取时间为30 min、45 min、60 min。

3） 超声萃取温度对竹荪蛋多酚得率的影响

超声萃取温度对竹荪蛋多酚提取含量的影响见图3。

图3 超声萃取温度对竹荪蛋多酚提取含量的影响Fig.3 The effect of ultrasound temperature on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由图3可知，当超声萃取温度在30℃～60℃，随着超声萃取温度升高，得率逐渐提高，在60℃时达到峰值，后随着超声萃取温度升高，得率趋于下降。可能是由于温度过高会导致部分多酚类物质结构不稳定、极易分解或挥发变性，或溶液中杂质溶出量增加，而使多酚类物质的提取率明显降低[16]。据此选择超声温度60℃左右作为响应面的分析水平。

2.1.2 响应面试验结果及分析

1） 响应面试验结果

选择超声时间（A）、乙醇浓度（B）、超声萃取温度（C），根据Box-Behnken组合试验设计原理，设计响应面分析试验。以竹荪蛋多酚得率作为响应值设计响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验设计试验结果Tab.2 Experiment results of response surface analysis

对表2试验数据分析后，获得了多酚得率对超声时间、萃取温度和乙醇浓度的回归方程，确定以多酚得率为目标函数的回归模型为：

对上述方程进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表3可知，该回归方程的回归效果达到极显著水平 （P＜0.000 1）；模型的决定系数 R2为 0.985 0，说明模型与实际拟合较好；模型调整决定系数R2adj为0.965 7，说明该模型能解释96.57%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不相符的概率，表3中模型失拟项的P值为0.455 7＞0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表3的显著性分析结果，超声萃取温度（C）、乙醇浓度（B） 对响应值影响显著 （P＜0.05），AA、BB、CC 以及 AC、BC 的交互项对多酚得率的影响极显著（P＜0.01）。各因素对多酚得率影响大小顺序依次为超声萃取温度（C）＞乙醇浓度（B） ＞超声时间（A）。

2） 响应面分析

根据回归方程绘制响应曲面图，并根据拟合的响应曲面形状，探讨超声时间、萃取温度及乙醇浓度对竹荪蛋多酚得率的影响。将模型中的超声时间、超声萃取温度及乙醇浓度分别固定在初始水平，得到其他因素的交互影响结果，响应面及其等高线见图 4～图 6。

图4 超声时间和乙醇浓度的响应面图Fig.4 Response surface and contour of ultrasonic time and ethanol concentration

图5 超声萃取温度和乙醇浓度的响应面图Fig.5 Response surface and contour of ultrasonic temperature and ethanol concentration

图6 超声萃取温度和超声时间的响应面图Fig.6 Response surface and contour of ultrasonic time and ultrasonic temperature

由图4～图6可知，影响竹荪蛋多酚得率的最显著因素为超声萃取温度（C），极值条件在等高线的圆心处，反应出其响应面变化较大。其次是乙醇浓度（B）。超声时间（A） 响应面弧度平缓，说明其响应值的影响较小。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。因此，超声时间（A）与超声萃取温度（C） 之间，乙醇浓度（B） 与超声萃取温度（C）间对多酚得率有显著交互影响。

2.1.3 验证试验

根据Box-Behnken试验所得的结果和回归方程，得到最佳提取条件为：超声时间45.4 min，乙醇浓度64.9%，超声萃取温度62.3℃，多酚得率理论值可达 5.87 mg·g-1。

为检验模型预测值与实际值之间的相关性，检验响应面优化模型的准确性，试验验证了灵芝子实体中多酚得率。根据最佳提取条件进行3次平行试验，测得多酚得率分别为 5.70 mg·g-1、5.74 mg·g-1、5.69 mg·g-1。实际的多酚平均得率为 5.71 mg·g-1，达到了回归模型理论预测值的97.27%。试验结果与模型契合良好，说明该模型能较好地预测和模拟竹荪蛋多酚得率。

2.2 竹荪蛋多酚抗氧化结果

2.2.1 DPPH·清除能力统计

竹荪蛋多酚对DPPH自由基清除能力的统计结果见图7。

图7 竹荪蛋多酚和VC对DPPH·的清除能力结果统计Fig.7 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol and vitamin C on DPPH·

DPPH·法是评价天然化合物抗氧化能力的一种有效而灵敏的方法。由图7结果表明，竹荪蛋多酚的DPPH·清除能力随其浓度的增加而增强。竹荪蛋多酚的浓度为0.8 mg·mL-1时，其DPPH·的清除率为85.73%，超过0.8 mg·mL-1浓度后，清除率未增加。

2.2.2 超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力测定

竹荪蛋多酚对O2-·自由基清除能力的统计结果见图8。

图8 竹荪蛋多酚和VC清除超氧阴离子自由基的能力结果统计Fig.8 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol and vitamin C on Superoxide anion

如图8所示，在测试浓度范围内，竹荪蛋多酚表现出很强的清除能力。在0.8 mg·mL-1浓度时，竹荪蛋多酚对O2－·生成的抑制率为77.47%，竹荪蛋多酚具有较强的O2－·清除能力。

2.2.3 羟基自由基（·OH）清除能力统计

竹荪蛋多酚对羟基自由基清除能力的统计结果见图9。

图9 竹荪蛋多酚清除·OH的能力统计结果Fig.9 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol on hydroxyl radical

从图9可以看出，竹荪蛋多酚对·OH的清除能力均与其浓度的增加呈正相关。在0.8 mg·mL-1浓度时，竹荪蛋多酚对·OH的抑制率为77.26%。

3 结论

通过响应面试验设计，利用超声萃取方法，得到竹荪蛋多酚的最佳萃取工艺条件为：超声时间45.4 min，超声萃取温度62.3℃，乙醇浓度64.9%，该条件下的多酚得率为5.71 mg·g-1。体外抗氧化试验表明，竹荪蛋多酚具有一定的抗氧化能力，当竹荪蛋多酚的浓度达到0.8 mg·mL-1时，其对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为85.73%、77.26%、77.47%，且其抗氧化能力与多酚浓度存在一定的量效关系。

食用菌多酚是食用菌中提取的具有两亲结构和诸多衍生化反应活性的一类次生代谢产物，据报道[17]灰树花（Polyporus frondosus）、竹荪（Dictyophora indusiata）、金针菇（Flammulina velutipes） 等食用菌的多酚具有抗病毒、抗氧化等作用。试验结果表明，竹荪蛋多酚也具有较强的抗氧化能力，具有很好的开发前景。