UPLC-MS/MS 法同时测定三黄片中5 种成分的含量

岳磊，张丹，黄丽杰，李晓静

1.郑州市食品药品检验所，河南 郑州 450000；2.郑州大学第三附属医院，河南 郑州 450000

作为一种临床常用的中成药，三黄片是从东汉张仲景《金匮要略》中“三黄泻心汤”的方剂中衍生而出的，最初的方剂配伍是由大黄、黄芩、黄连三味药材组成。历经各版药典收载，在《中国药典》2015年版制法中规定，由大黄、盐酸小檗碱和黄芩浸膏三味处方组成，具有清热解毒，泄火通便的功能［1］。检测标准使用HPLC 法，以三套不同的液相条件，分别针对大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、盐酸小檗碱及黄芩苷分别进行含量测定，其流程繁琐，耗时较长［2］。其他分析方法还有薄层色谱法、紫外合并红外光谱法，HPLC 法、UPLC 法及UPLC-QTOF/MS 法。除此之外，也有使用主成分分析法针对分析结果进行统计分析的研究［3-9］。近年来在中药分析领域，UPLC-MS/MS 法得到了更多的应用［10-11］。质谱检测法在测定多种成分的时，对被测成分在液相条件下的分离度没有强制要求，响应更加灵敏的同时更具有针对性。通过对三黄片中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷及盐酸小檗碱的液相条件和质谱条件进行优化，使之成为一种更加便捷的测定方法，可以在日常工作中帮助检验检测人员有效地提高检验工作时的工作效率和准确程度，为更全面地针对不同厂家，不同批次的三黄片进行质量控制提供更好的技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪，型号：ACQUITY UPLC（美国Waters）；线型离子阱质谱分析仪，型号：4000 QTrap（美国Sciex）；电子分析天平，型号：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超声波清洗机，型号：SB-800DTD（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

对照品分别为：大黄素（110756-201512，98.7%）、大黄酚（110796-201922，99.4%）、大黄素甲醚（110758-201817，99.2%）、黄芩苷（110715-201619，93.5%）、盐酸小檗碱（110713-201814，86.7%），均为中国食品药品检定研究院生产；三黄片为河南省及郑州市2018-2020年度安全监督抽检样品；乙腈、甲醇（德国Merck）；甲酸（美国Fisher）。

2 试验方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱柱：CORTECS UPLC C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）；流动相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱程序（0～3 min，20%→90%A；3～4 min，90%A ；4～4.1 min，90% →20%A ；4.1～5 min，20%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。ESI 离子源；正、负离子实时切换扫描；多重反应监测（MRM）。大黄素等5 个成分的具体质谱参数见表1。

表1 黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷和大黄素的质谱参数

2.2 混合对照品溶液制备

分别称取5 种对照品（大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷及盐酸小檗碱）约10 mg（精确至0.01 mg），置于100 mL 容量瓶，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别使用移液器量取适量体积，置于10 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液，对应各浓度分别为1.051 2 μg/mL、1.037 5 μg/mL、1.057 0 μg/mL、19.753 6 μg/mL、5.205 0 μg/mL。

2.3 供试品溶液制备

分别取不同批次三黄片各10 片，糖衣片除去包衣后研细（薄膜衣片直接研细），取约0.1 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL 锥形瓶，加入70% 甲醇50 mL，称重（精确至0.000 1 g）。满功率超声30 min，取出后放至室温，再次称重，如出现重量损失的情况，添加70%甲醇直至重量与超声前一致，摇匀后使用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

取《中国药典》三黄片制法项下除去主药外的空白药用辅料约0.1 g（精确至0.000 1 g），按“2.3”项下的方法制得阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

分别取稀释后的混合对照品溶液（精密量取混合对照品溶液5 mL，置于50 mL 容量瓶，加适量甲醇稀释至刻度），供试品溶液及阴性对照溶液，按“2.1”项下的条件进样，结果见图1。结果显示：5种目标化合物在供试品及稀释后的混合对照品溶液的选择离子流图（XIC）中在相同时间均有出峰，而阴性对照溶液XIC 图中对应时间均无信号干扰，专属性强。

图1 5种成分的提取离子流图：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液

2.6 线性关系考察

取“2.2”项下的混合对照品溶液1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、50.00 mL（精确至0.01 mL），分别置于100 mL 容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行回归方程计算，各成分在对应范围内的线性关系良好。见表2。

表2 线性关系、检测限和定量限

2.7 精密度试验

取“2.5”项下的稀释后的混合对照品溶液，按“2.1”项下的条件连续进样6 次。结果显示，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷及盐酸小檗碱峰面积的RSD 分别为4.24%、4.45%、3.74%、2.13%、2.17%，表明仪器的精密度符合要求。

2.8 重复性试验

随机选取同一批号的三黄片细粉（批号为1812010）6 份，平行制备6 份供试品溶液，进样测定。测得各成分的平均含量分别为1.377 mg/片、0.373 mg/ 片、0.762 mg/ 片、16.361 mg/ 片、4.357 mg/ 片，其RSD 分别为3.89%、4.18%、4.76%、2.32%、2.18%，表明本方法重复性符合要求。

2.9 稳定性试验

随机选取“2.8”项下任意一份平行样，在室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h 后测定。结果各成分的RSD 分别为4.27%、4.85%、4.61%、2.03%、2.68%，表明该供试品溶液样品在室温下12 h 内稳定性符合要求。

2.10 加样回收率试验

称取6 份“2.8”项下细粉各约0.05 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL 锥形瓶，再精密加入混合对照品溶液适量，按照“2.3”项下步骤制备6 份加标供试品溶液，计算加样回收率，结果显示，各成分的平均加样回收率分别为87.65%、90.36%、84.21%、95.83%、92.73%，其RSD 分别为2.54%、2.75%、3.31%、2.57%、2.41% 。

2.11 供试品含量测定

取10批三黄片样品（规格均为小片，其中9批糖衣片，1批薄膜衣片），按照“2.3”项下步骤制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样，通过“2.6”项下回归方程计算含量，结果见表3。

表3 供试品含量测定结果（mg/片）

3 讨论

3.1 目标成分的选择

相较于其他中成药，三黄片的处方较为特殊，从制法上看，盐酸小檗碱作为单一成分入药，黄芩以浸膏形式入药，且两者用量相对较少，直接针对盐酸小檗碱及黄芩苷进行含量测定。而大黄则是一半以浸膏形式入药而另一半直接制成细粉入药，且用量较大，药典方法以大黄素和大黄酚含量之和作为综合考量，而本文中增加了大黄素甲醚作为含量测定对象，使用液质联用方法，一次性针对其中的目标成分进行检测，从而对其进行更为全面的质量控制研究。

3.2 提取方法的优化

针对供试品前处理中的提取方式、选用溶剂与提取时间进行了优化研究。其中提取方式选择了直接超声和回流提取，结果显示二者提取率差异较小，而超声提取操作较为便捷。选择的溶剂包括甲醇、50%甲醇、70%甲醇与90%甲醇，最终选用提取率较高的70%甲醇。超声提取时间在15 min、30 min与45 min 之间进行对比，结果表明选用超声30 min的样品，其提取率明显高于15 min，与45 min的样品相比差别不明显。经综合考量，最终确定选用提取溶剂为70%甲醇，超声提取时间选择30 min。

3.3 色谱条件的优化

流动相的优化先采用相同比例的甲醇-水、甲醇-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）进行考察。结果显示使用乙腈作为有机相时，其图谱的峰型比甲醇的更好，目标化合物的分离程度也更好；而对比加入0.1%的甲酸的水相与纯水相，可明显看到加入0.1%的甲酸可以有效增强这5种化合物的信号强度，也能改善峰形的对称性。最后考察了不同梯度的洗脱方式，进一步提升了分离效率。最终选择乙腈-水（含0.1%甲酸）作为流动相，采用梯度洗脱方式进行试验。

10批样品测定结果中可以看出，由于盐酸小檗碱以原料药细粉入药，各批次含量结果差异最小；以黄芩苷作为黄芩浸膏原料的特征成分，各个批次含量结果差异也相对较小；以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚作为大黄药材细粉及浸膏原料的特征成分来看，呈现出较大差异。其中相同厂家不同批次之间差异较小，不同厂家之间各组分含量及相应比例均有较为明显的差异。