高效液相色谱法测定槐仙颗粒中黄芩苷的含量

余春辉，刘红英

1.丰城市中医院，江西 丰城 331100；2.江西领行药物研究所有限公司，江西 樟树 331200

槐仙颗粒是由丰城市中医院中医师以《太平惠民和剂局方》中的“槐角丸”为基础方加减而来，该制剂由槐角、地榆、防风、当归、黄芩、麸炒枳壳、仙鹤草七味中药制成。其功能主治为清肠疏风，凉血止血，润肠通便；用于肠风便血，痔疮肿痛，肛门瘙痒，便秘脱肛、肛裂等症［1］。为了建立槐仙颗粒质量标准，本研究用高效液相色谱法对制剂中黄芩的含量进行测定并建立标准限度，为制剂报批备案提供确实可行的技术依据。

处方中黄芩主含黄酮类化合物，包括有黄芩素，黄芩新素，黄芩苷，汉黄芩素，汉黄芩甙等［2-9］。实验选择方中主药黄芩中的黄芩苷作为定量指标控制，以有效地控制本品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT 输液泵，SIL-20A 自动进样器，SPD-20A 检测器，CTO-20A 柱温箱，DGU-20A5R脱气机。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110715-200212）；槐仙颗粒由医院制剂室提供，规格：15 g/袋，10批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱拓谱C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相，流速1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温35 ℃。进样10 μL；理论板数按黄芩苷峰计算均大于2 500。

2.2 溶液的制备

对照品溶液的制备：取60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率150 W，频率40 KHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取1 mL，至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，即得。

阴性样品溶液的制备：按处方取除黄芩的其他药材，依制法制成阴性样品，再依供试品溶液制备方法制成黄芩阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件测定，色谱图见图1；结果显示：黄芩苷对照品和制剂中的其他组分均能达到基线分离。

图1 黄芩苷对照品、供试品、阴性样品溶液HPLC图谱

2.4 空白试验

精密吸取10 μL 阴性样品溶液按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1，结果阴性样品无干扰，方法具专属性。

2.5 线性关系的考察

精密称取黄芩苷对照品24.1 mg 置25 mL 量瓶中摇匀并稀释至刻度，精密量取3 mL 至50 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，得57.84 μg/mL。再分别精密吸取5 μL、10 μL、12 μL、15 μL、20 μL，2.1 项下色谱条件测定分析，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，黄芩苷对照品的量为横坐标绘制标准曲线（黄芩苷对照品溶液标准曲线图）,计算得回归方程：Y=4 000 000X-18 033，R2=1。结果表明黄芩苷在0.289 2 μg～1.156 8 μg 范围内具有良好线性关系。

2.6 精密度试验

分别精密吸取黄芩苷对照品溶液（57.84 μg/mL）10 μL 重复进样6 次，测定峰面积，各对照品溶液的峰面积积分值的相对标准偏差0.63%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

取槐仙颗粒样品（批号：20200701），依据“2.2”方法配置成供试品溶液，在室温放置，分别于0、2、4、6、8 h 进样测定，供试品溶液中黄芩苷在放置8 h 内的峰面积基本一致，相对标准偏差为0.26%，表明所制备的供试品溶液中黄芩苷在8 h 内稳定。

2.8 重复性试验

取槐仙颗粒样品（批号：20200701）6 份，依据“2.2”方法配置成供试品溶液，测定黄芩苷的含量，结果样品中黄芩苷含量的相对标准偏差为0.65%，表明此法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取同一批已知含量的槐仙颗粒样品（批号：20200701），精密称取样品约10 g，各6 份，分别定量加入黄芩苷对照品，依2.2 方法制备供试品溶液，测定黄芩苷含量。计算加样加收率，结果平均回收率为99.09%，RSD 为1.84%,表明加样回收率良好，见表1。

表1 黄芩苷回收率试验结果

2.10 样品测定

取槐仙颗粒不同批次的样品10批，依“2.2”方法制备供试品溶液，测定黄芩苷含量，计算每克颗粒含黄芩苷的量，见表2。

表2 10批样品含量测定结果（mg/g）

根据上述测定结果，结合《中国药典》2015年版一部黄芩药材中规定的黄芩苷含量限度［10］，以及本品黄芩苷的转化率，暂将本品每克含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于1.6 mg。

3 讨论

（1）为了保证所测成分的灵敏度，实验还对波长进行了选择，取黄芩苷对照品溶液进行光谱扫描，结果对照品在277.84 nm 处有一较大的吸收峰，结合《中国药典》2015年版一部黄芩药材中黄芩苷含量测定项下的检测波长为280 nm，故选择280 nm为检测波长。（2）为了确保各组分的分离及出峰时间，实验对流动相进行了选择比较，实验对流动相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）和甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）进行了比较，结果流动相甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）黄芩苷对照品出峰时间过早，峰形较差。采用甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相，黄芩苷与其他组分分离完全，结果满意。（3）为了确保成分的充分提取，实验比较了不同提取溶剂（70%乙醇及甲醇）、不同提取方法（70%乙醇超声及70%乙醇回流）的样品制备方法，最终确定70%乙醇超声方法。既节能、环保，又操作方便。（4）本品方中主药为槐角、黄芩，分别对该二味药进行了大量研究，结果槐角苷含量较黄芩苷含量明显偏低，且干扰较多，故不列入质量控制标准。依《中国药典》2015年版一部黄芩药材项下标准选择黄芩苷作为定量指标控制，以有效地控制本品的质量。实验证明，采用高效液相色谱法对本品中的黄芩苷进行定量，方法简便、灵敏，重现性好。为院内制剂槐仙颗粒的质量控制提供了依据。