感冒热毒清合剂质量标准提高研究

刘洁琼，戴安印，濮晓燕，郭胜才

中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院，浙江 杭州 310013

感冒热毒清合剂是中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院（以下简称本院）根据名老中医验方并结合临床实践研制而成的中药非标准制剂，质量稳定、起效快、临床疗效好。该制剂由连翘、知母、金银花、蒲公英、板蓝根、石膏等7 味中药组方，具有清热解毒、辛凉解表、抗菌消炎等功效，临床上主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、急慢性扁桃体炎、咽喉炎、发热等病症。感冒热毒清合剂已在本院生产使用近30年，原质量标准只有绿原酸和连翘苷的薄层鉴别，无有效成分定量测定，为贯彻实施“军队医疗机构制剂标准提高计划”，参照2015年版《中国药典》和有关文献［1-7］，对感冒热毒清合剂的质量标准进行了修订，改进了金银花与绿原酸的鉴别方法和含量测定方法［4］，增加了蒲公英、知母的薄层鉴别，提高了制剂的质量标准，有效地控制制剂的生产质量，使制剂质量更稳定，保证临床用药安全有效。现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司，万分之一）；Cary 50 分光光度计（德国贺利氏瓦里安公司）；H.H.S4 数控恒温水浴锅（上海浦东跃欣科学仪器厂）；KQ-100DY型医用数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

甲醇（HPLC纯，中国淮安市恒天工贸有限公司）；乙腈（HPLC 纯，中国淮安市恒天工贸有限公司）；纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-201415，含量96.2%）；连翘苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110821-201514，含量93.5%）；其他试剂均为分析纯。感冒热毒清合剂样品（本院制剂室提供，规格：250 mL，批号20171023、20171121、20180126）；阴性样品按标准处方和制法制备。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 金银花取本品5 mL，加稀盐酸调节pH 值至1～2，用乙酸乙酯提取2 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。取缺金银花的阴性对照品按标准处方和制法同法制成阴性对照溶液。称取绿原酸对照品适量，配成每0.5 mg/mL的甲醇溶液，作为对照品溶液。遵照《中国药典》2015年版四部通则0502 薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶H薄层色谱板上，用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于波长365 nm的紫外灯下观察。结果在供试品薄层色谱图中，与对照品色谱的相应位置，呈现相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液在相应位置无斑点，表明在此薄层色谱条件下其他药材对金银花鉴别无干扰。结果见图1。

图1 金银花薄层色谱图

2.1.2 知母取本品40 mL，用水饱和的正丁醇作为提取溶剂，振摇提取3 次，每次40 mL，合并提取液，水浴蒸干，残渣加20 mL 乙醇溶解，再加盐酸2 mL，加热回流1 h，放冷，加水10 mL，用石油醚20 mL（60～90 ℃）振摇提取2 次，合并石油醚提取液，水浴蒸干，残渣用1 mL 乙醇溶解，作为供试品溶液。取缺知母的阴性对照药材并按照感冒热毒清处方和工艺同法制成阴性对照溶液。另取知母对照药材粉末1 g，加稀乙醇20 mL，盐酸2 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用1 mL 乙醇溶解，作为知母对照药材溶液。遵照《中国药典》2015年版四部通则0502 薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷适量5% 香草醛硫酸溶液，置105 ℃烘箱，加热至斑点显色清晰。结果在供试品色谱图中，与对照药材薄层色谱相应的位置显相同颜色的斑点，阴性样品无显色斑点，表明阴性样品在此条件下对知母鉴定无干扰。结果见图2。

图2 知母薄层色谱图

2.1.3 蒲公英取感冒热毒清10 mL，用乙酸乙酯超声振摇提取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。按处方工艺取缺蒲公英的阴性对照品同法制成阴性对照溶液。另取蒲公英对照药材1 g，加水煎煮2 次，每次1 h，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇至含醇量60%，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，放冷，同法提取，蒸干提取液，残渣用1 mL 甲醇溶解，作为蒲公英对照药材溶液。按照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液和蒲公英对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-冰醋酸（30∶1∶2∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置波长365 nm 紫外灯下检视。感冒热毒清供试品薄层色谱图中，与对照品色谱的相应位置显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液在相应位置无相同斑点，表明对鉴别无干扰。结果见图3。

图3 蒲公英薄层色谱图

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱为DiamonsiL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-1%醋酸（20∶80）；检测波长327 nm，流速1.0 mL/min，柱温为室温。理论塔板数按绿原酸色谱峰计算不低于2 000。

2.2.2 溶液制备对照品溶液制备：精密称取绿原酸对照品0.012 7 g，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为对照品贮备液。精密量取此对照品贮备液3 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1 mL 含60.96 µg的对照品溶液，即得。供试品溶液制备：精密量取感冒热毒合剂25 mL，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30 min（功率300 W，频率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。空白溶液制备：精密量取照感冒热毒清处方和配制工艺制备的缺金银花的阴性对照溶液25 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30 min（功率300 W，频率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 专属性分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10 μL，在“2.2.1”色谱条件下分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4。结果：对照品绿原酸主峰的保留时间为12.38 min，供试品溶液中的绿原酸保留时间为12.50 min，供试品溶液与对照品溶液绿原酸主峰的保留时间基本一致，在此色谱条件下溶剂及其他中药成分不干扰绿原酸的测定，表明方法专属性良好。

图4 高效液相色谱图：A.阴性对照品溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液

2.2.4 线性关系精密量取对照品贮备液1、2、3、4、5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性系列供试液。精密量取上述供试液各10 μL，分别进样，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，求出绿原酸的线性回归方程为Y=34.93X-142.30，r=0.999 2，表明绿原酸在20.32 μg/mL～101.60 μg/mL 浓度范围内，线性关系良好。

2.2.5 精密度试验精密吸取2.2.2 项下对照品溶液10 μL，照“2.2.1”色谱条件注入高效液相色谱仪，重复进样6 次，记录色谱图，测定峰面积，计算相对精密度RSD，6 次进样绿原酸色谱图峰面积的RSD 为0.29%，表明精密度结果良好。

2.2.6 重复性考察精密量取同一批次的感冒热毒清合剂（批号20180126）25 mL，共6 份，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，依法测定含量。结果绿原酸含量的RSD 值为1.09%，表明本方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，在“2.2.1”色谱条件下，分别于0，3，6，9，12，24 h 时进样，测定绿原酸峰面积，计算峰面积RSD，测得RSD 为1.58%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h 基本稳定。

2.2.8 回收率试验精密量取已知含量的感冒热毒清合剂供试品（批号20180126）12.5 mL 9 份，置于9个50 mL 容量瓶中，编号，分别精密加入“2.2.2”项下对照品储备液1、3 和5 mL，加50%甲醇适量，超声处理30 min（功率300 W，频率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，配成高、中、低3个绿原酸浓度水平的加样溶液，每个浓度水平平行做3 份，滤过，取续滤液10 μL，照2.2.1 色谱条件注入液相色谱仪，分别计算平均回收率。实验数据及结果见表1。

表1 绿原酸加样回收率试验结果（n=9）

2.2.9 样品含量测定取3批感冒热毒清合剂（批号为20171023、20171121、20180126），按“2.2.2”制备供试品溶液，取10 μL，照2.2.1 色谱条件进样，按外标法以峰面积计算绿原酸含量。结果依次为0.137、0.138 和0.129 mg/mL。

3 讨论

感冒热毒清是本院使用多年的自制制剂，由七味中药经提取制成，为有效控制制剂质量，保证患者使用安全有效，通过实验增加了知母、蒲公英的薄层色谱鉴别，简化了绿原酸薄层色谱展开系统，鉴别方法简单，操作简便，重现性好。

金银花为常用中药，现代药理研究表明，金银花具有抗炎抑菌、抗病毒等作用，其主要有效成分为绿原酸，制剂中的绿原酸有效成分可选择用乙醇或者甲醇来提取，通过大量预实验最终选择50%甲醇为提取溶剂，在此条件下对绿原酸的提取率较高，且无需萃取浓缩等预处理，感冒热毒清合剂可直接稀释并经超声后过滤，取续滤液进样，不但方法简便，操作方便，而且结果准确，分离度好，可以快速进行制剂质量检测。

查阅相关文献，测定绿原酸的高效液相色谱条件多选择乙腈-0.4%磷酸溶液或甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液三元体系作为流动相［4-7］，磷酸盐缓冲溶液易析出结晶，造成色谱系统堵塞，我们经过大量实验摸索，最终选择用甲醇代替乙腈，冰醋酸代替磷酸盐，以甲醇-1%冰醋酸（20∶80）作为流动相，结果表明，在此条件下绿原酸的色谱峰分离度佳，峰形良好，保留时间适中，且不会引起色谱系统堵塞，其他成分对测定无干扰，测定数据可靠、结果准确，便于分析测定。

综上所述，本试验采用薄层色谱鉴别蒲公英、知母和金银花，RP-HPLC 测定绿原酸含量，方法简便快捷，灵敏度高，重复性好，结果准确，适用于医院制剂感冒热毒清合剂的质量控制。