米饭焖制过程中焦香味及危害物的生成与关联

邵帅臻，夏书芹*，张晓鸣，龚艳玲，李 晶

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.美的电热电器制造有限公司，广东 佛山 528311）

随着生活水平的改善，消费者对米饭品质的要求也逐渐提高，电饭煲蒸煮米饭的风味受到人们的关注。在传统的柴火饭、煲仔饭等烹饪过程中，由于不均匀加热或者过度受热，会发生美拉德反应并且在器具接触面形成一层锅巴，从而赋予米饭特殊的焦香风味，为食用者带来愉悦感。目前生产的电饭煲还未形成成熟的焦香蒸煮程序，并且缺乏对焦香风味的评判标准。因此，确定焦香型米饭的特征风味物质并形成针对性调控策略对电饭煲的设计与改良具有指导价值。

谷物类食物在烘烤、油炸等加工过程中都会逐渐脱水变干，温度也不断上升，最后发生包括美拉德反应等的一列反应，生成吡嗪[1]、噻唑[2]、糠醛[3]等挥发性物质，这些物质被证明与焦香风味密切相关[4]。目前鉴定得到的米饭风味物质达300多种，包括各种醛、酮、醇、酯、杂环类等物质，但是区分香稻和非香稻的化合物仅有2-乙酰基吡咯啉一种[5]。糙米直接通过烘烤可以生成糠醛、5-甲基糠醛、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2-乙基-3，5-二甲基吡嗪等风味物质[6]。然而，谷物类食物若未合理控制热加工参数也会生成5-羟甲基糠醛、丙烯酰胺[7]等危害因子，这些物质有潜在的致癌风险[8-10]。在进入焖饭阶段前，由于米粒被持续加热，其中的淀粉糊化程度已经达到较高水平，米粒间的游离水分已消耗殆尽。此时继续进行加热，由于锅底温度较高使得底部米粒中的构造水蒸发，而上部米饭的水分来不及向下转移，因此锅底的米饭温度会持续上升造成失水变干。脱水后的米饭一方面质构变脆，慢慢达到锅巴的口感；另一方面米饭中的各种物质发生以美拉德反应为主的化学反应，生成多种挥发性风味成分，甚至有可能生成5-羟甲基糠醛、丙烯酰胺等潜在危害因子。虽然有颇多关于其他食物在高温下生成的各种风味物质及危害物的报道，但缺少将焦香型米饭在热加工过程中形成的各种物质进行剖析，并探寻这些产物之间的相互关联性。

采用气-质联用对焦香米饭的特征性风味物质进行鉴定，考察焖饭阶段的温度与时间对米饭焦香风味的影响，并基于美拉德反应中间产物形成途径探索焖饭阶段参数对危害因子实现控制的原因，通过寻求米饭焦香风味物与危害成分的平衡从而明确电饭煲焖饭阶段最佳的升温参数，为焦香米饭风味的定向调控和电饭煲蒸煮程序的合理设计提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

徽两优丝苗米：安徽燕之坊食品有限公司产品；5-羟甲基糠醛（5-HMF纯度99%）、丙烯酰胺（AM纯度99%）、2，4，6-三甲基吡啶（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司产品；1-脱氧-1-L-谷氨酸-D-果糖、1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖：子起生物科技有限公司产品；乙二醛：美国Sigma-Aldrich公司产品；丙酮醛：日本TIC公司产品；2，3-丁二酮：美国Sigma-Aldrich公司产品；甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司产品；硫酸镁、邻苯二胺、氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品；十八烷基硅烷键合硅胶、N-丙基乙二胺（分析纯）：博纳艾杰尔科技（天津）有限公司产品。

1.2 仪器与设备

CFXB型电饭煲（4 L）：广州轻工集团股份有限公司产品；QP2010型气相嗅闻系统：岛津公司产品；KCMG程序控温仪：余姚精创仪表有限公司产品；DVB/CAR/PDMS萃取头：上海安普科学仪器有限公司产品；7890A气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司产品；UPLC-TQD超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪：美国沃特世公司产品；HH-2型数显式恒温水浴锅：荣华仪器有限公司产品；5810R冷冻高速离心机：Eppendorf公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 米饭蒸煮方法称取100 g丝苗米，快速清洗2遍，按照米水质量比1∶1.4进行蒸煮。加热主程序参照市面主流电饭煲，使用KCMG程序段控温仪控制，温度传感器置于电饭煲底部中心。程序可以控制任意煮饭阶段的温度和持续时间，加热功率为400 W。电饭煲加热主程序及各煮饭阶段如图1所示，分为T1~T55个阶段。T1为电饭煲第一快速升温阶段，T2为浸泡阶段，T3为第二快速升温阶段，T4为沸腾阶段，T5为焖饭阶段。T5焖饭阶段参数设置为，温度：100、125、150、175、200℃；时间：10、20、30 min。

图1 电饭煲程序的升温曲线Fig.1 Heating curve of rice cooker program

1.3.2 米饭挥发性风味物质测定

1）固相微萃取（SPME）条件 准确称取10 g电饭煲蒸煮后锅底的米饭，加入饱和氯化钠溶液至总质量为40 g，加入20μL的2，4，6-三甲基吡啶（质量浓度0.276μg/mL）作为内标进行定量。萃取头老化后固定在米饭上方约1 cm处，在70℃水浴条件下萃取吸附30 min后将萃取头插入进样器解吸8 min，进样口温度设置为250℃。

2）气相（GC）条件DB-WAX弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.2μm）；载气（He）流量0.8 mL/min；升温程序：初始柱温40℃，持续3 min，然后以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，持续7 min；分流设置为不分流。

3）质谱（MS）条件EI离子源温度250℃，传输线温度250℃，检测器电压1 000 V，发射电流80μA，电子能量70 eV。

4）挥发性风味物质的分析 通过比对NIST17标准质谱库；注入C7—C30的正构烷烃进行GCMS分析，得到正构烷烃的保留时间，通过Kratz法计算保留指数的方法对所有风味成分计算保留指数；己醛、壬醛等8种物质通过比对标准物质的保留指数，其余没有标准物质的通过文献对照保留指数定综合确定挥发性风味成分；通过内标2，4，6-三甲基吡啶对所有挥发性风味物质进行定量。

5）挥发性风味物质香气活度值 香气活度值（OAV）为某种挥发性风味物质含量除以该物质在常温下水中的阈值。

1.3.3 米饭特征性风味物质的鉴定由经专业筛选过的评价员基于气-质-嗅闻（GC-MS-O）系统采用时间-强度法对米饭的气味特征进行鉴定。分析方法同1.3.2挥发性物质测定的条件。实验过程中分别记录每种挥发性风味物质的保留时间、气味强度以及气味的具体描述。气味强度由弱至强共分为4个等级：1为气味很弱，2为气味较弱，3为气味中等，4为气味较为明显，5为气味非常明显。

1.3.4 米饭中丙烯酰胺（AM）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）的痕量测定

1）萃取方法 基于文献采用分散固相萃取的方法进行样品预处理[11]。将米饭用液氮快速冷冻、打粉，制成米饭粉末。称取5 g米饭粉末样品于50 mL离心管中，然后加入20 mL乙腈用均质机进行匀浆（8 000 r/min，3 min）。 加 入0.5 g NaCl和1 g MgSO4，立即旋涡振荡1 min后离心（8 000 r/min，5 min），取5 mL上清液加入120 mg十八烷基硅烷键合硅胶、100 mg N-丙基乙二胺迅速旋涡振荡1 min后离心（8 000 r/min，5 min），取上清液进样分析。

2）液质联用方法 液相色谱条件：C18柱（50 mm×2 mm，2.5μm），流动相为水和甲醇，等度洗脱程序：V（甲醇）∶V（水）=5∶95。进样体积为10μL，柱温40℃。

数据在正离子模式下多反应监测（MRM）获得。采集ESI的参数为：喷雾电压3 500 V，碰撞能量（CE）=15 eV，离子源温度600℃，源气体和辅助气体流量设定分别为15 L/min和18 L/min。用于分析5-HMF的MS/MS产物离子参数如下：母离子（m/z为127.1），子离子包括（定量离子，m/z为109.2）m/z为53.1、81.1。用于AM的MS/MS产物离子参数如下：母离子（m/z为72.1），子离子（定量离子m/z为55.1和定性离子m/z为44.1）。采用外标法进行定量分析。

1.3.5 米饭中Amadori化合物及二羰基化合物的痕量测定

1）衍生化方法 基于文献采用邻苯二胺衍生化的方法[12]。称取10 g米饭样品，加入30 mL去离子水和10 mL质量浓度为20 mg/mL的邻苯二胺水溶液，均质混匀后，在100 W超声波下超声15 min，10 000 r/min离心15 min，取2 mL上清液加入4 mL的甲醇溶液，充分混匀后静置10 min，再次以10 000 r/min离心15 min。

2）固相萃取方法 向5 mL的C18萃取小柱中加入5 mL甲醇进行活化，然后加入5 mL超纯水淋洗萃取小柱进行平衡。取衍生化后的样品上清液进行上样，待样液流干后加入5 mL超纯水淋洗，最后用3 mL体积分数为50%乙腈-水溶液洗脱，全程流量控制为3 mL/s，洗脱液过0.22μm有机膜，处理后的样品避光冷藏保存。

3）液质联用方法 色谱条件：C18柱（50 mm×2 mm，2.5μm），流动相为甲醇（A相）和水（B相），梯度洗脱程序的体积分数：初始条件为B相100%，2~6 min内B相由100%变为90%，6~8 min内B相由90%变为50%，8~10 min内B相由50%变为100%，10 min后B相保持100%维持10 min，总运行时间20 min。进样体积为0.5μL，柱温40℃。

质谱基本参数与1.3.4一致，用于分析的MS/MS产物离子参数[12-13]如表1所示，采用外标法进行定量分析。

表1 Amadori化合物及二羰基化合物的MS参数Table 1 MS parameters of Amadori compounds and dicarbonyl compounds

2 结果与分析

2.1 米饭特征性风味物质的鉴定

为明确挥发性物质对焦香米饭风味的影响，采用GC-MS-O对挥发性风味化合物进行鉴定，通过嗅闻、保留指数以及数据库的匹配进行风味物质的定性分析。对不同温度下焖制10 min得到的米饭样品进行嗅闻强度的比较，结果如表2所示。通过比较发现，GC-MS-O分析总共得到了19种挥发性风味物质，这些风味物质对米饭的整体风味均有一定程度的贡献。其中噻唑类物质、吡嗪类物质、糠醛类物质均为焦香米饭（焖饭温度>100℃）特有的风味成分。糠醛类物质的风味强度很弱，是焦香米饭中少量糊味及苦味的来源之一[14]。只有噻唑类物质和吡嗪类物质的嗅闻强度为较弱以上，对焦香米饭的整体风味贡献程度最高，且随着温度的升高，这两种物质的嗅闻强度也逐渐提高。

表2 米饭的风味活性物质及气味强度Table 2 Aroma intensity and characteristic flavor compounds of cooked rice

续表2

由于GC-MS-O为非标准定量仪器，难以对物质进行直接定量分析。采用GC-MS结合内标法对挥发性风味化合物进行定量，再综合风味化合物的阈值，可以获得挥发性风味物质的香气活力值（OAV）。该指标是风味物质的含量与其在某种基质中阈值的比值，可反映相应风味的强度。一般认为OAV>1，则该物质对风味有贡献，记为特征性风味物质。对嗅闻到的19种物质，比较其在所有程序中最大的含量及对应的OAV值，最终将7种物质确定为焦香米饭的特征性风味物质，结果如表3所示。

表3 基于OAV确定的特征性风味物质Table 3 Characteristic flavor substances based on OAV

醛类物质是米饭中常见的风味物质[15]，在低浓度下赋予米饭清甜香和水果香。在各种醛类物质中，己醛和壬醛含量最高，而且己醛的OAV值也最高，达到24，是最重要的醛类物质。米饭中的脂肪质量分数虽然仅有2%，但是其在蒸煮过程中易水解后成低级的脂肪酸，并进一步被氧化生成脂肪醛[16]。米饭中的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚OAV值很低，具有丁香、咖喱等辛香风味，丰富了整体米饭风味轮廓，其可能通过阿魏酸氧化反应与微生物途径产生[17]。

吡嗪类物质是焦香风味最重要的来源[1]，具有坚果香、爆米花、烤香等风味，含量较高的同时有着极低的阈值，因此3-乙基-2，5-二甲基吡嗪的OAV值最高，达到121。从表2中可以看出，吡嗪类物质的嗅闻强度随着温度的升高以及时间的延长而增加。在100℃的条件下，未检测到吡嗪，这是由于吡嗪的生成受着米饭温度、含水率、pH等因素的影响[1]。噻唑类物质与吡嗪类物质都是高温下美拉德反应的产物，噻唑主要是含硫氨基酸产生[18]。在米饭中更容易生成吡嗪类物质，而且大部分噻唑的阈值更高，因此噻唑对OAV的贡献较低。4-甲基噻唑只有在150℃以上才能生成，特别是在200℃下会大量生成。4-甲基噻唑具有烤肉香，对焦香风味的轮廓具有烘托作用。噻唑类物质是含硫氨基酸的Strecker降解产物，所以往往会伴随着H2S等刺激性气味的产生。

2.2 焖饭参数对焦香米饭特征性风味物质的影响

米饭的气味是影响其食用品质的关键因素之一，它是由不同种类、不同含量的风味化合物混合而成的，各种挥发性物质的组合会得到风味迥异的米饭。为明晰焖饭温度及时间与米饭焦香风味物质组成及含量的关系，采用气质联用测定了7种特征性挥发性风味物质的质量分数，结果如图2所示。

通过比较发现，己醛和壬醛为所有焖饭程序中均含有的成分。其中，己醛含量会随着焖饭温度的升高以及焖饭时间的延长呈现下降趋势。而壬醛含量相对稳定，各不同焖饭程序下的差异不明显。造成这种现象的原因可能是二者的沸点不同（常压下己醛130℃，壬醛191℃），并且由于它们均为油脂氧化产生，所以加热温度越高，加热时间越长，其损失越多。

吡嗪类物质为焦香的最重要的特征性风味成分，其阈值很低，焦香米饭中的吡嗪含量较高[19]。甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和3-乙基-2，5-二甲基吡嗪这3种物质均随着焖饭温度的升高和焖饭时间的延长而增加。由图2（a）可见，当焖饭时间为10 min时，只有温度升至150℃以上才能产生吡嗪类物质，并且随着焖饭温度的升高变化明显；而当焖饭时间延长至20~30 min时（见图2（b）和2（c）），吡嗪类物质在125℃就已经产生，且在175℃和200℃这两个焖饭温度下的差别要远小于较短焖饭时间下的样品。这可能是因为美拉德反应的程度与温度和水分活度密切相关，延长了焖饭时间，会降低米饭中的水分活度，并在一定程度上提高了米饭中心温度。但是在20 min和30 min以及175℃和200℃的极端条件下，美拉德反应趋于平缓，此时可能受制于米饭中还原糖和氨基酸的含量，而导致反应达到了平衡。

图2 不同焖饭温度及时间下焦香米饭特征性风味物质的含量Fig.2 Contents of characteristic flavor substances of burnt rice under different stewing temperature and time

噻唑类物质同样由美拉德反应产生，但是与几乎所有氨基酸都可产生吡嗪不同，噻唑必须有含硫氨基酸参与反应。米饭中的含硫氨基酸仅占总氨基酸质量分数的5%以下[20]，因此噻唑类物质的生成对温度程序的要求很高。当焖饭时间为10 min时，仅在200℃的焖饭温度下才能检测到4-甲基噻唑；即使焖饭时间延长到30 min，也只有焖饭温度在150℃以上的样品中才能检测到该物质。

2-甲氧基-4-乙烯基苯酚会随着焖饭温度的升高而增加，而焖饭时间在20 min之后达到最大值。这可能是稻米中的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚在高温下逸出，且在20 min之后达到平衡。2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的前体物质为稻米胚芽中的阿魏酸，稻米中的内源酶与外源性的微生物均可能促进生成2-甲氧基-4-乙烯基苯酚[17]，该过程往往发生在大米的储藏过程中。在焖饭阶段，过高的温度使内源酶与微生物失活，因此焖饭阶段的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的含量变化主要为米饭形态结构的变化，而使得原本结合于淀粉与蛋白质内部的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚逸出。

2.3 焖饭阶段参数对潜在危害因子的影响

丙烯酰胺（AM）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）均为烘烤油炸类食物热加工过程中风味物形成的同时伴生的危害因子[21]。其中，5-HMF是5-甲基糠醛、糠醛等糠醛类物质的上游产物[14]，也是焦香米饭的焦苦味的重要来源。高温焖饭过程中也可能产生AM和5-HMF等危害物，因此需对其进行定量并将含量超过安全限值的参数作为焦香米饭的蒸煮程序的上限温度和时间。作者采用分散固相萃取-液质联用的方法对不同焖饭参数下所得米饭中的5-HMF和AM进行同时分析，结果如图3所示。

图3 不同焖饭程序下米饭中伴生危害物的质量分数Fig.3 Content of associated hazards in rice under different stewing programs

根据欧盟委员会的条例[10]，饼干等烘烤谷物类制品的丙烯酰胺质量分数应控制在0.35 mg/kg，由图3（a）可见，只有175℃、30 min，200℃、20 min，200℃、30 min这3个条件下焖制米饭中的AM质量分数超过此限值。根据联合国卫生组织的添加剂规范[9]，5-HMF通过大量急性和亚急性动物毒理实验得到每人每天540μg的标准，按照每人每天食用250 g米饭计算，上限为2.16 mg/kg。由图3（b）中结果可见，同样只有上述3个条件下焖制米饭中的5-HMF超过此限值。AM与5-HMF均为美拉德反应产物，因此与焦香风味的产生趋势几乎一致。在考虑到安全限值后，为了尽可能最大化提升米饭香气，选用175℃、20 min或者200℃、10 min作为米饭焦香焖饭程序。以甲基吡嗪为例，175℃、20 min焖饭程序下的质量分数为（177±10）μg/kg，而200℃、10 min焖饭程序下则为（88±6）μg/kg，前者远高于后者，其他吡嗪以及噻唑类的风味物质也是如此。因此，综合考虑吡嗪类风味物质的生成以及伴生危害物的控制，选择175℃、20 min作为适宜的焖饭加热参数。

2.4 焦香米饭特征风味物形成及伴生危害物的控制机制

焦香米饭的焦香特征性风味成分如吡嗪类物质和噻唑类物质均与美拉德反应有关[22]，此外，危害产物5-羟甲基糠醛（5-HMF）和丙烯酰胺（AM）等有害产物也会随着美拉德反应的进行而生成。从图4可知，危害产物与焦香特征性风味成分的部分反应路径重合，如5-HMF的前体为脱氧酮糖，该物质可裂解生成二羰基化合物，进而生成特征性风味成分，而脱氧酮糖为Amadori化合物的水解产物。因此，如果能找到米饭焖饭阶段中Amadori化合物与二羰基化合物的生成变化规律，有助于促进特征性风味成分的生成并控制有害因子。

图4 焦香米饭美拉德反应生成风味物质及危害产物的路径Fig.4 Pathway of Maillard reaction of burnt rice to produce flavor compounds and harmful products

前期实验分析表明米饭中的还原糖主要为葡萄糖，氨基酸为谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸。天冬酰胺在高温下与葡萄糖生成丙烯酰胺，谷氨酸、丙氨酸分别与葡萄糖发生亲核加成并重排，形成稳定的美拉德反应中间体：1-脱氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu）和1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala）[23]。而通过葡萄糖生成的脱氧酮糖可以生成3种二羰基化合物，分别为乙二醛（GO）、丙酮醛（MGO）、丁二酮（2，3-BD）。不同焖制条件下米饭中这5种物质的质量浓度如图5所示。

图5 不同焖饭条件下的美拉德反应中间产物Fig.5 Maillard reaction intermediate products under different stewing conditions

吡嗪类化合物中的碳原子全部由二羰基化合物提供，因此可以根据二羰基化合物的种类和数量直接决定了吡嗪类物质的种类和数量：如吡嗪前体二羰基化合物为2分子的GO，甲基吡嗪前体二羰基化合物为1分子的GO和1分子的MGO。由图4可知，Amadori化合物为各风味成分和5-HMF的前体物质，二羰基化合物则为风味物质的直接前体产物，与5-HMF等有害产物无直接关系，但是生成二羰基化合物与5-HMF两条反应路径之间可能存在竞争关系。因此在可以积累和生成更多的二羰基化合物的前提下，应尽可能减少Amadori化合物的生成，即可降低5-HMF的产生。Amadori化合物的性质稳定，在较低温度下就可反应生成；而二羰基化合物相对性质活泼，且需要较高的反应温度。由图5（a）可知，当焖饭时间为20 min、焖饭温度为100℃时，这5种美拉德反应中间产物均未检测出。而在125℃时，Fru-Glu大量产生，Fru-Ala的生成量次之，且明显高于3种二羰基化合物的质量分数。随着焖饭温度的升高，尤其是上升到175℃时，GO和MGO显著提高，此阶段大量的二羰基化合物的生成导致吡嗪类物质的焦香风味成分的产生。Amadori化合物在此阶段上升不是很明显，Fru-Ala的质量分数在175℃和150℃无明显差异。200℃条件下，两种Amadori化合物的含量均有显著提高，这可能是由于高温下水分的损失使得各种还原糖和游离氨基酸的相对浓度提高，并且美拉德反应逆向反应程度减弱，使得Amadori化合物的逐步生成并持续累积。由图5（b）可见，维持焖饭温度175℃并延长焖饭时间，Amadori化合物持续产生，而二羰基化合物的GO和MGO在20 min后大量生成。2，3-BD的生成条件相对更加严苛，在30 min后才能大量产生。3种二羰基化合物中，MGO质量浓度最高，2，3-BD质量浓度最低，这可能与葡萄糖结构有关，1分子葡萄糖最容易裂解为2分子MGO。

3 结语

通过SPME-GC-MS对不同焖饭程序下丝苗米饭中的挥发性风味物质进行分析，发现甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪和4-甲基噻唑是焦香的特征性风味物质，尤其以吡嗪类物质为主，赋予米饭烤香、坚果香等风味，这些物质随着加热温度的升高以及时间的延长而增加。醛类物质和酚类物质如己醛、壬醛、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚等，是米饭基本的特征性风味物质，尤其是醛类物质为主，赋予米饭清甜香，醛类物质随着加热时间和温度的变化略微下降或是变化不明显。焖制温度在125℃以上的焦香米饭中均存在5-HMF，而焖制温度在150℃以上逐渐产生AM，且两者在175℃以上随着加热温度的升高而快速增加。基于米饭焖制过程中美拉德反应中间产物之间的转化机制发现175℃、20 min的焖饭条件最有利于二羰基化合物的形成和积累，从而产生大量风味成分；在此焖饭温度和时间下Amadori化合物的质量分数相对较低，从而使得5-HMF能维持在较低水平，从而保证焦香风味与安全性的平衡。