燕窝消化特性的体外实验

王 鑫，范群艳，连建梅，邹锋扬，王雅馨，李建贵，陈茂深*，钟 芳，李 玥

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.厦门市燕之屋丝浓食品有限公司，福建 厦门 361101）

燕窝为雨燕科金丝燕属鸟类分泌的唾液与其羽绒混合凝结而成的物质，营养价值丰富，具有多种生物活性[1]。燕窝主要营养成分为蛋白质、碳水化合物、唾液酸，同时含有微量的脂质和无机元素。唾液酸是燕窝的核心物质，是脑神经节苷脂的有益成分。燕窝的生物活性和其消化特性有关。研究发现，燕窝经过消化后抗氧化活性显著提高，能够保护细胞免受氧化损伤[2]。Ghassem等发现燕窝模拟消化产物中的多肽组分具有较高的抗氧化能力，分离纯化发现其中PFHPY和LLGDP两种肽能够保护HepG2细胞免受H2O2诱导的氧化损伤[3]。Wong等研究发现，消化后的燕窝具有更强的美白活性和成骨活性，能够抑制酪氨酸酶的活性，减少小鼠黑色素瘤细胞中的黑色素分泌量，同时促进成骨细胞增殖，增加小鼠的骨强度和真皮厚度[4]。

唾液酸对酪氨酸酶活性具有剂量依赖性的抑制作用，对皮肤有美白功效[5]。多肽和唾液酸是消化产物中的主要功能活性成分。目前关于燕窝的研究主要集中在原料的品质伪劣鉴定和生物活性评价，关于燕窝消化特性的研究没有详尽的报道。作者采用Standard法模拟炖煮燕窝体外胃肠的消化，对燕窝蛋白和碳水化合物的含量和组成进行了全面的测定分析，为进一步开发高胃肠消化特性的燕窝新产品提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

燕窝：市售；胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma公司产品；鼠李糖，半乳糖，甘露糖，邻苯二胺盐酸盐，国药化学试剂有限公司产品；氨基葡萄糖、D-半乳糖胺盐酸盐、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸：上海创赛有限公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

傅立叶红外光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司；PowerPacTMBasic Power Supply基础电泳仪电源：伯乐生命医学产品上海有限公司产品；摇摆式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司产品；DL-5-A低速台式大容量离心机、KDN-08C数显温控消化炉：上海新嘉电子有限公司产品；UV-2802紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；KDN-103F凯氏定氮仪：上海纤检仪器有限公司产品；高效液相色谱仪Waters 2695（Waters 2475荧 光 检 测 器、Waters 2998紫 外 检 测 器）：美 国Waters公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理将燕窝研磨成粉末，用60目筛子过滤，收集过滤粉末，装袋，-20℃贮藏。

1.3.2 模拟体外消化过程利用Standard法模拟胃肠消化：称量0.8 g燕窝粉末，溶于10 mL水中，沸水水浴1 h，冷却至室温[6]。将燕窝溶液与10 mL的模拟胃液混合于50 mL离心管内，37℃恒温振荡水浴，HCl调节pH使其始终保持在2.0±0.2，在100 r/min的速度下模拟胃阶段消化，每个时间点单独做一个消化管，每隔30 min依次用碱液调节pH至8.0灭酶，以4 500 g离心分离上清液，-20℃贮藏，分析0，30，60，90，120 min的消化情况。胃消化结束后，进入小肠消化阶段。加入16 mL模拟肠液，NaOH调节pH使其始终保持在7.0±0.2，补水使体系达到40 mL。继续在100 r/min的搅拌速度、37℃的温度下进行肠阶段体外消化，每个时间点单独做一个消化管，每隔30 min将一个离心管进行沸水浴灭酶，4 500 g离心分离，上清液-20℃贮藏，离心沉淀物进行冻干储藏，分析150，180，210，240 min的消化情况。

1.3.3 基本成分测定蛋白质含量测定：参照国标GB 5009.5—2016凯氏定氮法，蛋白质折算系数6.25，分别测定燕窝原料蛋白质含量和消化上清液中的水溶性蛋白质含量；总糖含量测定：参照国标GB/T15672—2009苯酚硫酸法，葡萄糖为标准品，分别测定燕窝原料总糖含量和消化上清液中的总糖含量。

1.3.4 水解度测定参考杨文博等人的方法，采用甲醛滴定法[7]。水溶性蛋白质水解度（%）=ρ×V/m （1）式中：ρ为消化上清液中游离氨基酸态氮质量浓度，g/mL；V为消化液体积，mL；m为消化上清液中的燕窝蛋白总氮质量，g。

1.3.5 多肽测定方法参考GB31645—2018胶原蛋白肽的测定。色谱条件：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；柱温：30℃；流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸，体积比为40∶60∶0.05。检测器：紫外检测器220 nm；流量：0.5 mL/min；进样体积10μL。

1.3.6 蛋白质二级结构测定方法采用Nicolet iS50 FTIR型傅立叶变换红外光谱仪测定。扫描次数32次，入射角45°，扫描波数范围4 000~600 cm-1，分辨率为4 cm-1。测试样品粉末衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR），每个样品重复采集3次。

1.3.7 唾液酸测定方法参考袁玲和张启伟等人的方法，采用领苯二胺（OPD）柱前衍生法测定燕窝原料和消化上清液的唾液酸含量[8-9]。

取50 mg原料溶解在40 mL的体积分数1%磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，冷却后加入20 mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系滤膜过滤，准备进样。

游离态唾液酸测定，取1 mL液体样品，加入20 mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1 mL，50℃避光水浴2.5 h，改变温度至4℃继续衍生48 h，水系滤膜过滤，准备进样。

聚糖态唾液酸测定，取1 mL液体样品，按 体积比1∶1加入Sevage试剂（V（三氯甲烷）∶V（正丁醇）=4∶1）反复萃取除去蛋白质，加入20 mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系滤膜过滤，准备进样。

蛋白态唾液酸测定，取1 mL消化上清液酸解，测定清液中唾液酸总量。

未溶解唾液酸测测定，取50 mg燕窝消化后的离心沉淀物，溶解在40 mL的1%体积分数磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，80℃避光水浴40 min，水系滤膜过滤，准备进样。

1.3.8 单糖测定方法参考戴军等人方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法测定燕窝原料和消化上清液的单糖组成[10]。

1.3.9 蛋白质相对分子质量测定方法取消化液与上样缓冲液等体积均匀混合，100℃加热3 min变性处理，8 000 r/min离心3 min。还原电泳条件：10 g/dL分离胶，5 g/dL浓缩胶，上样量10μL。对燕窝糖蛋白中的蛋白和糖链分别进行单独染色，考马斯亮蓝R-250进行蛋白染色，高碘酸-席夫碱法进行糖染色[11]。Image Lab图像软件用于SDS-PAGE凝胶分析。

1.3.1 0数据统计与分析所有数据均进行3次重复测定，采用SPSS19.0和Origin 8.0进行处理和统计分析。

2 结果与讨论

2.1 燕窝主要组成成分

蛋白质和碳水化合物是人类生命活动的必需营养物质，而唾液酸是脑神经节苷脂的重要组分，直接参与神经系统改善和大脑发育。燕窝蛋白主要为唾液酸糖蛋白，其主要成分如表1所示。

表1 主要化学成分Table 1 Main chemical composition of samples

蛋白质质量分数为67.86%，唾液酸质量分数13.25%，其余单糖的总质量分数16.45%。燕窝的化学组成与其品种、产地关系紧密，Hamzah等对马来西亚、印度尼西亚等不同产地燕窝的蛋白质和唾液酸分析，蛋白质质量分数在59.8%~73.8%，唾液酸质量分数10%左右，与研究结果一致[1]。研究发现，日常饮食中的高蛋白质食物如黄豆，其蛋白质质量分数仅为36.3%，远低于燕窝[12]。燕窝是唾液酸质量分数最高的食物，而奶粉中的唾液酸质量分数仅为0.05%[13]。

对燕窝中单糖组成进行测定，结果如表2所示。可以看出燕窝总糖主要由6种单糖组成，其中，半乳糖质量分数最高，达到6.59%，其次为N-乙酰半乳糖胺4.15%和甘露糖3.22%。研究发现不同地区如越南、印度尼西亚和泰国的燕窝单糖组成中，N-乙酰葡萄糖胺（4.76%~5.64%）、N-乙酰半乳糖胺（3.79%~4.54%）和半乳糖（4.58%~5.43%）质量分数较高，在其他定量中，发现鼠李糖（0.02%）和木糖（0.21%）。燕窝单糖质量分数的差异受产地和加工过程影响[1]。

表2 燕窝原料单糖组成Table 2 Monosaccharide composition of raw materials of bird’s nest

2.2 消化过程中溶解燕窝蛋白质、总糖、唾液酸溶解度变化

燕窝的生物活性和其消化特性有关，对燕窝消化过程中蛋白质、总糖、唾液酸的溶解性进行研究，结果如图1所示。

图1 消化过程中燕窝蛋白质、总糖、唾液酸溶解度变化Fig.1 Changes of solubility of protein,total sugar and sialic acid during digestion of bird’s nest

消化初始阶段，燕窝蛋白质溶解度为13.85%，胃阶段消化2 h后增加到28.75%，肠阶段继续消化2 h后增加到47.23%。总糖溶解度为7.49%，经过胃消化2 h后增加到24.92%，肠消化2 h后增加到39.02%。整个消化过程中蛋白质和总糖的溶解度呈显著线性正相关（r=0.984，P＜0.01），溶解速率较为一致，糖与蛋白质结合紧密，共同溶解到消化上清液中。唾液酸溶解度的变化情况与蛋白质、总糖不同，炖煮燕窝消化开始时刻的唾液酸溶解度为18.69%，胃消化前30 min内溶解度快速增加，达到31.45%，30 min后溶解速率降低，溶解度缓慢增加，胃消化2 h后仅为35.34%。肠消化过程中唾液酸溶解度的变化与胃阶段类似，前30 min内唾液酸溶解度再次快速增加，达到42.85%，30 min后溶解度趋于平缓，肠消化2 h后为44.24%。

2.3 消化过程中蛋白质水解度和多肽相对分布

水解度可以表征蛋白质肽键的断裂程度，多肽相对分布表征蛋白质水解产物的具体情况。燕窝蛋白质的水解度如图2（a）所示。

胃肠消化后，燕窝总蛋白质的水解度分别为5.47%、12.12%。消化上清液中水溶性蛋白质的水解度分别为13.48%、18.13%。胃消化阶段，水溶性蛋白质的水解主要发生在消化前30 min。肠消化阶段，水溶性蛋白和总蛋白质的水解度呈现显著正相关，胰蛋白酶有助于提高燕窝蛋白的溶解度。郭立春等用胰蛋白酶水解胶原的总蛋白质水解度为20%，和胶原蛋白相比，燕窝水解度较低[14]。

图2 燕窝消化过程中水解度和多肽相对质量分数变化Fig.2 Changes of hydrolysis degree and molecular weight of polypeptide during digestion of bird’s nest

多肽相对分布如图2（b）所示，消化开始时刻，炖煮燕窝溶液中主要为蛋白质。胃消化前30 min，燕窝中的水溶性蛋白质被快速水解成低聚肽（＜1 000）和中等相对分子质量肽（1 000~5 000），而大相对分子质量肽段（5 000~10 000）和蛋白质（＞10 000）相对质量分数较少。30 min后多肽相对分布趋于稳定，低聚肽和蛋白质质量分数略有增加，中等相对分子质量和大相对分子质量肽段相对质量分数减少。胃消化2 h后，低聚肽、中等相对分子质量肽段和大相对分子质量肽段的相对质量分数分别为36.6%、45%、5.96%，而蛋白质相对质量分数为12.47%。燕窝蛋白为酸性蛋白质，其中相对分子质量1.28×105和1.06×105蛋白质为相对质量分数最高的蛋白质，这两种蛋白的等电点pH≤3，进入胰阶段，消化液pH由酸性变成中性，蛋白质更易溶解从而被胰蛋白酶水解。肠消化前30 min，在胰蛋白酶的作用下，多肽相对分布发生显著变化。低聚肽和蛋白质相对质量分数分别增加15.28%、23.06%，中等相对分子质量肽减少39.3%，大相对分子质量肽相对质量分数没有显著变化，30 min后多肽相对分布趋于稳定。肠消化2 h后，低聚肽、中等相对分子质量肽段和大相对分子质量肽段相对质量分数分别为51.88%、5.65%、6.94%，蛋白质相对质量分数为35.53%。

2.4 消化过程中单糖质量分数变化

Yagi等研究发现燕窝中的糖与蛋白质共价结合，同时含有O连接型和N连接型糖蛋白[15]。N型和O型糖蛋白的糖链并不是单一的直链糖，存在多个分支。N-乙酰半乳糖胺是O型糖蛋白中特有的单糖，可以表征O型糖蛋白的溶解度。N型糖蛋白中复杂型聚糖结构的唾液酸含量最高，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和甘露糖是N型聚糖中最主要的糖，其糖链的结构如图3所示。燕窝的单糖组成有助于判断消化过程中溶解的燕窝糖蛋白的类型。燕窝消化后的单糖包括甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和氨基葡萄糖。不同单糖之间的溶解度存在差异，结果见表3。

图3 燕窝唾液酸聚糖结构Fig.3 Structure of sialic acid glycan from bird’s nest

消化开始时刻N-乙酰半乳糖胺的溶解度仅为3.92%，经过胃肠消化后溶解度为24.73%，O型糖苷键在中性和碱性条件下一般较为稳定，在酸性条件更易被水解。该糖溶解度低说明O型糖蛋白不易被消化。胃肠消化后，N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖的溶解度达到49.65%、46.61%、16.36%。N型糖蛋白溶解度更高，可能是因为N型糖苷不如O型糖苷稳定性好，它在水中容易水解，推测溶出的N型糖蛋白以复杂型和杂合型为主。对燕窝消化离心上清液中以聚糖链形式存在的4种单糖相对含量进行相关性分析，结果如表4所示。糖链中的单糖均呈显著正相关，说明燕窝中的糖链结构完整，胃肠消化过程中燕窝的糖链未被水解。

2.5 消化过程中唾液酸存在形式和质量分数变化

唾液酸是燕窝中最具有价值的物质，在哺乳动物大脑发育的过程中不可或缺。燕窝中的唾液酸主要结合在糖蛋白的糖链末端，少量以游离和聚糖的形式存在。外源性含唾液酸的食物在哺乳动物的代谢研究表明，游离唾液酸虽然有利于人体吸收，但是单体唾液酸在体内的滞留时间太短，无法充分吸收利用。与蛋白质结合的唾液酸可以延长其在体内的滞留时间，但是难以被转化吸收。和低聚糖或者聚糖肽结合的唾液酸在体内的滞留时间合适，同时也有利于吸收利用[16]。燕窝唾液酸在消化过程中的存在形式和质量分数变如图4所示。

表3 燕窝消化过程中单糖溶解度Table 3 Monosaccharide dissolution rate during the digestion of bird’s nest%

表4 燕窝单糖相关性分析Table 4 Correlation analysis of bird’s nest monosaccharide

图4 燕窝消化过程中唾液酸的存在形式和质量分数变化Fig.4 Changes of sialic acid in the process of bird’s nest digestion

消化开始时刻，游离态唾液酸质量分数为6.42%，胃消化2 h后达到13.69%，肠消化2 h后达到17.41%。胃阶段，游离态唾液酸质量分数明显增加，主要是受胃阶段低pH的影响。胃消化过程中，聚糖态唾液酸质量分数始终维持在1%左右，而蛋白态唾液酸质量分数在消化前30 min内增加了10%，之后一直维持在20%左右。胃消化过程中，胃蛋白酶在远离燕窝糖基化的位点作用，唾液酸与蛋白质稳定结合。肠阶段，聚糖态唾液酸质量分数明显增加，肠消化2 h后达到11.85%，蛋白态唾液酸质量分数减少了6.82%，推测胰蛋白酶在靠近燕窝蛋白糖基化的位点作用，生成更多的聚糖态唾液酸。原料中的唾液酸经过胃肠消化后17.41%以游离形式存在，11.85%与聚糖结合，14.98%与蛋白质结合，仍有55.76%无法溶解到消化上清液中，唾液酸总的消化利用率较低，且聚糖态唾液酸含量较少，无法被有效吸收。

2.6 消化过程中燕窝糖蛋白结合程度分析

通过电泳蛋白质染色和糖染色分析消化过程中糖链和蛋白质的结合程度，结果如图5和图6所示。

燕窝蛋白以大分子糖蛋白为主，相对分子质量128 000和108 000，糖染颜色显著。Zhang等研究发现相对分子质量为128 000和106 000蛋白质占总蛋白质质量分数80%左右，唾液酸化程度分别为20%、17%[17]。胃消化的前30 min大分子蛋白质显著分解，50 000~75 000处生成明显的蛋白质涂层，该段蛋白质的糖含量最高。37 000、20 000的蛋白糖含量较低，15 000处有小分子蛋白质的堆积条带，糖链的颜色最浅。胃阶段消化反应30 min后条带的类型没有明显变化。肠消化过程中，100 000~150 000的大分子蛋白进一步降解，形成137 000、128 000、106 000三条清晰条带，这些大分子蛋白质具有抗消化性。50 000~75 000模糊的蛋白质涂层降解为50 000、60 000、73 000蛋白质条带，其中50 000蛋白糖含量最高。20 000、15 000处的蛋白质进一步降解形成多肽。整个消化过程中燕窝原料中的大分子糖蛋白被水解成集中在37 000~150 000的若干条条带，无法被进一步水解，糖链与蛋白质紧密结合。

图5 燕窝消化过程中蛋白质相对分子质量分布Fig.5 Protein molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

图6 燕窝消化过程中聚糖相对分子质量分布Fig.6 Glycochain molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

2.7 消化过程中难溶性蛋白质的二级结构相对质量分数变化

蛋白质的二级结构是评价蛋白质空间构象及其稳定性的重要指标。燕窝消化过中存在部分蛋白质始终难以溶解，现测定燕窝原料及消化过程中难溶蛋白的二级结构，结果如表5所示。

表5 消化过程中难溶于水的蛋白质二级结构质量分数Table 5 Secondary structure content of water insoluble protein during digestion

燕窝原料的二级结构中β折叠为51%，α螺旋17%，无规则卷曲13%，β转角19%。整个消化过程中难溶蛋白质的二级结构以β折叠和α螺旋为主，蛋白质空间结构的稳定性主要依靠β折叠的链间氢键和α螺旋的链内氢键等非共价键来维持。研究发现无规则卷曲、β转角等无序结构有利于蛋白酶进行水解作用[18]。燕窝中的难溶蛋白质的无序结构含量较低，不利于酶进一步水解。

3 结语

燕窝经过炖煮消化后，蛋白质溶解度仅为47%，仍有50%以上的蛋白质未溶解，推测其溶解性与蛋白质二级结构有关。蛋白质水解度11.5%，未被全部水解成具有高抗氧化活性的低聚肽，相对分子质量50 000~150 000存在大量蛋白条带，没有被完全消化。总糖溶解度39%，糖染结果显示消化过程中水溶性糖蛋白中的糖链与蛋白质结合紧密。唾液酸作为燕窝重要功能活性成分，消化后未溶解态唾液酸质量分数达到56%，唾液酸利用率有待提高。游离态唾液酸含量有利于提高燕窝的美白活性，燕窝消化后游离态唾液酸质量分数仅为17%，需要进一步促进燕窝消化后游离态唾液酸的释放。聚糖态唾液酸相比游离态唾液酸吸收稳定性更强，燕窝消化后的聚糖态唾液酸质量分数仅为12%，需要进一步提高。多肽和唾液酸是燕窝的主要功能活性成分，建议通过高温炖煮或其他酶水解等方法对燕窝进行加工，以进一步提高燕窝中蛋白质的溶解性以及燕窝消化后多肽、游离态和聚糖态唾液酸含量，提高燕窝的生物活性和生物利用度。