虾青素对乌鳢生长、抗氧化和免疫功能的影响

■李美鑫 刘曦澜 许世峰 祝新茗 李沐阳* 王桂芹

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

养殖水环境中不可避免的会同时出现多种应激源。温度、氨氮、溶氧、盐度的改变、重金属污染以及病原微生物入侵都会使养殖动物产生不同程度的应激[1-2]。各种应激源持续激活免疫系统，短期的免疫系统活化有助于机体免疫，但长期持续的激活免疫系统会引起鱼类免疫应激并诱导炎症反应[3]。炎症反应会促进免疫细胞大量分泌IL-1β，引起下丘脑-垂体-肾间轴（HPI）兴奋性增强，持续释放糖皮质激素，改变机体的营养代谢[4]。鱼类在应对内环境稳态失衡通常会做出一系列适应性反应，包括降低采食、减弱游泳活动，重新分配蛋白质和脂肪资源物质，将用于生长的部分资源用于合成免疫分子，阻碍了饲料营养的利用及生产性能的最大化发挥[5-6]。

虾青素（AST）是一种小分子化合物，化学结构中含有不饱和的羟基和酮基，是饲料添加剂目录中唯一允许使用的色素类添加剂[7]。虾青素在机体中能与肌红蛋白结合，使鱼类皮肤和鸟类羽毛呈现出艳丽的色彩，调控机体色素的沉积[8]。近年来营养和免疫相关学者研究发现，虾青素还可以促进动物生长，调节动物的非特异性免疫功能[9-10]。有研究发现，虾青素与类胡萝卜家族其他成员相比，具有更强的蛋白质和脂质过氧化抑制能力，还能保护DNA核酸分子完整性[11]。近年来，虾青素的免疫调节等生物学功能在医学领域越来越受到重视，然而在水产领域罕见报道。因此，本试验以特色淡水鱼乌鳢为研究对象，基于虾青素以上几方面的生物学功能，进一步研究虾青素对乌鳢生长性能、抗氧化、免疫和血清生化指标的影响，为虾青素作为免疫增强剂合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼及试验设计

试验鱼在过滤单循环水体驯化暂养14 d，饲喂基础饲料。试验开始，体重接近、状态良好的800尾乌鳢[初重为（23.40±0.53）g]，随机分成4组（每组5个重复，每重复40尾），水温（26±1）℃，pH（7.1±0.1），溶氧（6.21±0.41）mg/L，每天饱食投喂2次（08:00和16:00），记录投喂量，仔细观察鱼的游泳活动状态，乌鳢进食结束后吸取水面油膜及水底残饵，及时调整投喂量。试验周期为56 d，取样前禁食并用MS-222（300 mg/L）麻醉，称重后每个重复随机取5尾抽取尾静脉血制备血清，收集组织样品液氮速冻后转移-80℃保存备用。

1.2 试验饲料

参照乌鳢配合饲料标准配制颗粒饲料。参照课题组前期工作，在基础饲料中添加0、50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素（购自上海源叶生物科技有限公司），其中不添加虾青素组（0 mg/kg）为对照组，50、100 mg/kg和200 mg/kg为虾青素试验组，饲料配方及营养水平见表1。

表1 基础饲料配方及营养水平

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能指标

饲养结束后计算平均增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饲料效率（FE）。

平均增重率（%）=100×[末体重（g）-初始体重（g）]/初始体重（g）

特定生长率（%/d）=100×（ln末体重-ln初始体重）/试验天数（d）

饲料效率（FE）=总增重（g）/总摄食量（g）

1.3.2 抗氧化和免疫指标

乌鳢血清和肝脏组织（SOD）含量测定采用羟胺法、CAT含量测定采用可见光法、GSH-Px含量测定采用比色法，MDA含量测定采用TBA法，PC含量测定采用比色法。

乌鳢血清和脾脏组织：C3、C4、IgM、LZM含量采用免疫比浊法测定。

乌鳢血清：AST、ALT、碱性磷酸酶（ALP）活性和COR含量测定采用微板法、赖氏法测定，所用试剂购自南京建成生物工程研究所。

1.4 统计分析

数据经Excel初步整理后，采用SPSS 20.0单因素方差one-way ANOVA分析试验数据以确定显著差异，后进行Tukey多重比较，数据表示为“平均值±标准差”，P<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 虾青素对乌鳢生长及饲料利用的影响（见表2）

表2 虾青素对乌鳢生长及饲料利用的影响

由表2可知，与对照组相比，日粮添加100 mg/kg和200 mg/kg虾青素组显著提高乌鳢平均增重率、特定生长率和饲料效率（P<0.05），日粮添加50 mg/kg虾青素组对生长性能没有显著的影响（P>0.05）。

2.2 虾青素对乌鳢抗氧化指标的影响（见图1、图2）

如图1所示，日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著提高乌鳢血清和肝脏SOD活性（P<0.05），100 mg/kg和200 mg/kg虾青素组肝脏SOD活性显著高于其他日粮组（P<0.05）。日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著提高乌鳢血清和肝脏CAT和GSH-Px活性（P<0.05），200 mg/kg虾青素组血清CAT和GSH-Px活性最高，显著高于其他日粮组（P<0.05）。

图1 虾青素对乌鳢血清和肝脏抗氧化酶活性的影响

虾青素对乌鳢血清和肝脏MDA和PC的影响见图2。日粮添加100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著降低乌鳢血清和肝脏MDA和PC含量（P<0.05）。

图2 虾青素对乌鳢血清和肝脏MDA和PC的影响

2.3 虾青素对乌鳢免疫指标的影响（见图3）

如图3所示。日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著提高乌鳢血清和肝脏C3含量（P<0.05），各虾青素处理组血清和肝脏补体C4差异不显著（P>0.05）。100 mg/kg和200 mg/kg虾青素组血清IgM水平显著提高（P<0.05），各虾青素处理组肝脏IgM水平没有显著的提高（P>0.05）。100 mg/kg和200 mg/kg虾青素组乌鳢血清LZM活性显著提高（P<0.05），日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著提高乌鳢肝脏LZM活性（P<0.05）。

图3 虾青素对乌鳢血清和脾脏免疫功能的影响

2.4 虾青素对乌鳢血清生化指标的影响（见图4）

如图4所示，与对照组相比，日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著降低乌鳢血清ALT和AST活性（P<0.05）。日粮添加50、100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著降低乌鳢血清COR含量（P<0.05），血清中各组ALP差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 虾青素对乌鳢生长性能的影响

虾青素是一种能通过血脑屏障的小分子化合物，在水产养殖业中具有很广阔的应用前景。Hélène等[12]早期研究发现，饲料中添加虾青素可以缩短日本虾蜕皮周期并促进生长。Xie等[13]研究表明，饲喂虾青素显著提高金鲳特定生长率和体增重，提高金鲳生长性能。Li等[14]研究也表明，虾青素可以显著提高血鹦鹉的生长速度。Cheng等[15]研究也表明，饲料中添加100、200、400 mg/kg和800 mg/kg虾青素可不同程度地提高克氏原螯虾体增重和饲料效率。Jagruthi等[9]研究表明，饲喂50 mg/kg和100 mg/kg虾青素可以显著提高鲤的增重率，其中以50 mg/kg试验组体增重最佳。Liu等[16]研究也表明，饲喂虾青素显著提高黄颡鱼体增重、特定生长率和饲料效率。Alishahi等[17]研究发现，饲料中添加200 mg/kg虾青素显著提高白化奥斯卡鱼（Astronotus ocellatus）体增重和特定生长率。Cheng等[18]研究也表明，饲料中添加80～320 mg/kg虾青素可以提高河豚的体增重和特定生长率。本研究结果表明，日粮添加100 mg/kg和200 mg/kg虾青素显著提高乌鳢生长，而50 mg/kg虾青素日粮对生长性能没有显著提高作用。可见，饲料中添加虾青素具有促进水产动物生长的作用，然而其在水产动物的特定生长率、体增重和饲料效率上的影响也有很大差异，这可能是由于虾青素来源不同造成鱼种间实际需求量的差异。虾青素提高水产动物生长性能，可能原因包括：①虾青素通过调节鱼类HPI，促进抑制生长激素（GH）和类胰岛素生长因子（IGF）分泌及其受体的表达。②虾青素提高肠道消化酶的活性，同时促进食欲增加摄食量。

3.2 虾青素对乌鳢抗氧化指标的影响

氧化还原反应是鱼类维持正常生长必不可少的过程，免疫应激会影响正常的氧化还原反应，造成自由基蓄积[19]。水产动物肝脏组织易受自由基攻击产生MDA和PC等大分子过氧化产物[20]。鱼类抗氧化系统相比陆生养殖动物低等，同时鱼类在水生环境下同时受到多种来源的应激。因此，水产养殖过程中常需要外源添加抗氧化功能的免疫增强剂来辅助养殖动物缓解组织的氧化损伤。虾青素是一种天然的提取物，可直接参与自由基和超氧阴离子的清除反应[14]。Wang等[8]研究表明，虾青素可以显著提高中华绒螯蟹肝胰腺的抗氧化酶SOD和T-AOC的活性。Han等[21]研究表明，饲料中添加虾青素同样可以提高三疣梭子蟹抗氧化物质如SOD、CAT水平和GSH水平，减少MDA含量，调节异常的自由基代谢。组织中MDA含量反映脂质过氧化情况，同时也是评价机体氧化损伤最直观的指标。Cheng等[15]研究也表明，饲料中添加虾青素显著提高克氏原螯虾肝胰脏SOD、CAT等抗氧化酶水平。本试验研究结果表明，日粮添加虾青素显著提高乌鳢血清和肝脏SOD、CAT活性和GSH-Px活性，同时有效降低MDA含量和PC含量。姚金明等[7]研究表明，日粮添加虾青素显著提高大鳞副泥鳅肠道CAT、GSH-Px活性和SOD等活性，降低MDA含量，进一步从侧面佐证了本试验结果。Nrf2是参与机体氧化还原调节的转录因子，Xie等[13]研究表明，饲喂虾青素可活化Nrf2-ARE信号通路，提高金鲳低氧胁迫下肝脏抗氧化酶活性，促进机体抵抗氧化损伤能力。综上可知，虾青素可通过以下途径调节鱼类抗氧化功能：①提高内源酶的活性，抑制MDA生成，保护脂质蛋白大分子。②激活Nrf2-ARE途径分子，提高动物抗氧化损伤功能。

3.3 虾青素对乌鳢免疫指标的影响

虾青素在促进水产动物抗氧化功能的同时，对免疫功能也有不同程度的促进效果[21-22]。作为先天免疫的重要指标，溶菌酶和补体广泛分布在体液中，在防止动物体内病原性微生物的黏附和定植方面发挥着关键作用[23]。虾青素可以促进多种免疫活性物质分泌，如IgM、LZM、补体等[24]。IgM主要存在于鱼类血液中，能与补体相结合，通过非特异性免疫反应清除病原体[25]。本研究表明，日粮添加虾青素提高乌鳢血清和肝脏中IgM、C3水平和LZM的水平，进而促进机体免疫应答能力。Cheng等[15]、Liu等[16]和Jagruthi等[9]研究也表明，饲喂虾青素可以显著提高克氏原螯虾、黄颡鱼和鲤血清LZM水平和抗体水平、头肾巨噬细胞吞噬指数及嗜水气单胞菌的抗病性，与本研究结果基本一致。虾青素能促进机体免疫应答主要原因可能是由于：①虾青素可以增强抗体分泌细胞功能，促进溶菌酶等免疫活性物质的分泌；②虾青素可以激活补体系统，补体系统可分泌补体C3增强淋巴免疫细胞功能，促进IgM及其他免疫物质的分泌。

3.4 虾青素对乌鳢血清生化指标的影响

血清生化指标在一定程度上可反映鱼类应激水平，ALT和AST是鱼肝脏中重要的氨基转移酶并在肝细胞受损时进入血液，故血中转氨酶水平可在一定程度上反映肝脏健康程度。Cheng等[15]研究表明，饲料中添加虾青素显著降低克氏原螯虾血清ALT和AST水平。鱼类免疫应激状态下，血清中COR水平会快速升高，故COR是衡量鱼类应激程度的重要指标。Liu等[16]研究表明，饲喂虾青素显著降低黄颡鱼血清COR、葡萄糖和转氨酶含量。本试验研究表明，饲料中添加虾青素显著降低乌鳢血清COR含量及ALT、AST活性，与上述研究结果基本相符。此外，有研究指出COR的升高会抑制GH和IGF-1的分泌[26-28]。因此，虾青素促进生长性能可能与虾青素降低血清COR、保证正常的生长相关激素水平，同时降低血清ALT活性和AST活性、保护肝脏等重要的营养物质代谢器官、维持机体正常生理功能有关。综上所述，日粮添加50～200 mg/kg虾青素均不同程度地提高了乌鳢生长性能、血清和肝脏抗氧化能力，促进机体免疫应答。