发酵黄芩药渣对仔猪生长性能、氧化应激及免疫功能的影响

■安 琦 曹亚彬 牛彦波 吴皓琼 原 韬

（黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨 150010）

仔猪胃肠道发育不完善，免疫力低，易发生肠道疾病，随着我国全面禁止使用抗生素，部分小型养殖场仔猪因胃肠疾病病死率可达到20%～30%，对养殖业经济效益产生严重影响[1-2]。应用科学手段预防仔猪腹泻成为行业内关注的焦点。中草药在我国有广泛悠久的应用历史，饲料中添加适量的中草药，能够起到提高适口性、增强免疫力、提高增重等功效[3-4]。此外，中草药的毒副作用低，未发现耐药性和产品残留方面的问题[5]。目前，中药材利用率仅为30%～70%，中药渣中除了含有粗脂肪、粗蛋白质、氨基酸和微量元素等营养成分外，还残留有一定量的多糖、黄酮和皂苷等生物活性成分，可作为饲料添加剂[6-8]。研究表明，在养殖饲料中添加经过发酵处理的中药渣，不但可以增强畜禽的体质状况，还能够起到其他添加剂所达不到的药用功能，降低精饲料的用量，降低生产成本，提高养殖业的经济收入[9-12]。研究表明，日粮添加中草药添加剂可显著提高日增重、提高肌肉大理石纹评分、显著降低失水率、增加肌肉粗脂肪含量[13]。研究表明，用发酵五味子药渣添加剂饲喂断奶仔猪，发现仔猪的腹泻率和料重比降低，猪肠上皮内杯状细胞和淋巴细胞数量增多，仔猪的免疫功能有所提高[14-15]。

据统计，中药制药企业每年产生数以千万吨的中药药渣，多数生产厂家将药渣作为废料垃圾处理，造成了资源的巨大浪费和环境污染问题。如何有效利用药渣资源，避免药渣因长期堆放引起的环境污染是一个全新的课题。本研究采用的药渣来源于中药双黄连中主要原料——黄芩药渣，具有清热燥湿、泻火解毒等功效，主治上呼吸道感染、肺热咳嗽、肺炎、痢疾等症状[16-17]。本研究利用植物乳杆菌对黄芩药渣进行发酵，发酵后的药渣用于仔猪饲喂试验，观察其对仔猪增重、腹泻率、肠道微生物群落及免疫功能的影响。通过对黄芩药渣进行二次利用，旨在减少环境污染和资源浪费，为开发新型中药渣饲料添加剂提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物乳杆菌菌种为植物乳杆菌植物亚种(Lacto⁃bacillus plantarum)，分离自黄芩药渣。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.20963)。黄芩废渣取自双黄连生产过程中产生的中药废渣，药渣经粉碎，过20目筛网，备用。

MRS培养基：牛肉膏10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.28 g/L、吐温80 1.0 g/L、pH 6.2～6.4。

1.2 黄芩药渣发酵

取斜面菌种，于平板上进行三区划线，30℃倒置培养直至长出单菌落；单菌落接种于液体活化培养基进行培养，培养温度为30℃，时间24 h；将活化好的菌种接种于发酵罐中，控制温度37～43℃，时间24～36 h，制备发酵液。菌液中植物乳杆菌的含量≥108CFU/mL。

粉碎后的药渣加入物料总重量80%～100%的水，搅拌均匀；高压灭菌，物料厚度≤30 cm，120℃灭菌30 min；药渣粉降温至35～37℃；向冷却后的物料中加入植物乳杆菌菌液，接种量为5%，于密闭发酵罐中厌氧发酵72 h；发酵结束后测得pH为4.5，植物乳杆菌菌数≥108CFU/g，得到发酵药渣，平行处理无乳酸菌发酵黄芩药渣作为未发酵药渣备用。

1.3 仔猪喂养试验

选取大三元杂交健康无病的21日龄仔猪72头，随机分为3组，每组24头，采食同种饲粮，试验期为28 d，免疫和管理按猪场常规进行。试验分为黄芩药渣组、发酵药渣组、对照组。对照组仔猪仅饲喂基础日粮，试验组仔猪在基础日粮中分别添加黄芩药渣和发酵黄芩药渣，添加量为2 kg/t，基础日粮组成及营养水平如表1所示。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4 断奶仔猪日增重情况测定

试验仔猪分别于0、14 d和28 d空腹12 h后进行称重、记录，以计算不同时期及全期仔猪的增重情况。对0～28 d仔猪腹泻情况进行评定：观察并记录试验期每头仔猪每天的腹泻情况。

腹泻率（%）=试验期腹泻仔猪头次/（试验猪头次×试验天数）×100

1.5 断奶仔猪盲肠微生物菌群的测定

试验结束后，每组随机选取仔猪5头，打开腹腔，结扎盲肠两端，切下盲肠。在无菌操作台中，准确称取盲肠内容物1 g放于盛有99 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡，取稀释液进行10倍稀释，吸取0.1 mL稀释液接种于选择性培养基上。其中，大肠杆菌用伊红美蓝琼脂培养基37℃培养48 h后进行菌落计数；乳酸菌用MRS培养基37℃培养48 h后进行菌落计数。

1.6 断奶仔猪血清抗氧化指数的测定

试验28 d，各试验组随机选取健康状况良好、体重相近的仔猪5头，空腹前腔静脉采血30 mL，静置，3 000 r/min离心10 min，离心后血清分装于离心管中，-30℃保存待测。抗氧化指标的测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）活性、采用硫代巴比妥酸法（TBA）测定丙二醛（MDA）含量，具体步骤按试剂盒说明书操作。

1.7 血清免疫指标的测定

试验28 d，各试验组随机选取健康状况良好、体重相近的仔猪5头，空腹前腔静脉采血30 mL，静置，3 000 r/min离心10 min，离心后血清分装于离心管中，-30℃保存待测。血清免疫指标IgA、IgG、IL-4采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。

1.8 药理学毒性试验

选取体重为18～22 g的ICR鼠60只，经3 d适应性饲养后，随机均分为3组（雌雄各半），黄芩药渣、发酵药渣和空白对照组，每组各20只；空白对照组灌胃生理盐水，黄芩药渣、发酵药渣组将制备的制剂溶于水中灌服，黄芩药渣、发酵药渣的药物添加量为0.1 g/mL，0.4 mL/次，每日3次，连续7 d。每日观察试验鼠的精神状态、饮食情况，每日记录发病死亡情况；对于死亡鼠进行剖检观察内脏变化；对试验鼠进行定期称重；试验结束，采集血液分离血清，测定AST、ALT。称量ICR鼠体重，对其脏器指数进行测定，取ICR鼠心脏、脾脏、肝脏、肾脏、睾丸、卵巢，称重，按照下式计算脏器指数。

脏器指数（%）=脏器重/体重×100

1.9 长期毒性试验

根据制备的发酵药渣制剂，20、100 g/kg给1月龄ICR鼠连续灌胃给药30 d，观察动物的皮毛、肤色、摄食、活动、尿、便等有无异常。

1.10 数据处理与分析

所有采集数据采用Excel软件进行前期处理，然后用SPSS 19.0进行统计分析，LSD进行多重比较，结果采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 中药发酵饲喂对比试验

2.1.1 发酵药渣添加剂对断奶仔猪日增重及腹泻率的影响（见表2）

表2 发酵药渣添加剂对断奶仔猪日增重和腹泻率的影响

由表2可知，0～14 d平均日增重，黄芩药渣组较对照组提高5.98%，无显著性差异（P>0.05）；发酵黄芩药渣比对照组显著提高7.19%（P<0.05），较黄芩药渣组提高1.14%，无显著性差异（P>0.05）。15～28 d平均日增重，黄芩药渣组较对照组提高6.44%（P>0.05）；发酵黄芩药渣组较对照组显著提高45.62%（P<0.05），较黄芩药渣组显著提高36.80%（P<0.05）。0～28 d平均日增重，黄芩药渣组比对照组提高6.15%（P>0.05）；发酵黄芩药渣组较对照组显著提高29.38%（P<0.05），较黄芩药渣组显著提高21.88%（P<0.05）。0～28 d仔猪腹泻率，各试验组均显著低于对照组（P<0.05），其中发酵药渣组仔猪腹泻率最低。

2.1.2 发酵药渣添加剂对断奶仔猪盲肠微生物菌群的影响（见表3）

由表3可知，发酵黄芩药渣组的大肠杆菌数量显著低于对照组（P<0.05）；黄芩药渣组大肠杆菌数量低于对照组但无显著性差异（P>0.05）。发酵黄芩药渣组的乳酸菌和双歧杆菌数量显著高于对照组（P<0.05），其中乳酸菌数量显著高于黄芩药渣组（P<0.05）。黄芩药渣组乳酸菌和双歧杆菌数量高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。

表3 发酵药渣添加剂对断奶仔猪盲肠微生物菌群的影响

2.1.3 发酵药渣添加剂对断奶仔猪抗氧化性能的影响（见表4）

表4 发酵药渣添加剂对断奶仔猪抗氧化性能的影响

由表4可知，断奶仔猪血清中T-SOD含量黄芩药渣组较对照组提高14.66%，无显著性差异（P>0.05）；发酵药渣组较对照组显著提高了40.52%（P<0.05），较黄芩药渣组显著提高了22.56%（P<0.05）。

断奶仔猪血清中GSH含量试验组与对照组之间无显著性差异（P>0.05）。断奶仔猪血清中MDA含量黄芩药渣组较对照组降低51.61%，无显著性差异（P>0.05）；发酵药渣组较对照组分别显著降低62.97%（P<0.05），较黄芩药渣组降低23.48%（P>0.05）。

2.1.4 发酵药渣添加剂对断奶仔猪免疫指标的影响（见表5）

由表5可知，仔猪血清中IgA含量发酵药渣组高于对照组和黄芩药渣组但无显著性差异（P>0.05）。黄芩药渣组IgG含量较对照组提高2.41%，差异不显著（P>0.05）；发酵黄芩药渣组IgG含量较对照组显著提高42.08%(P<0.05)，较黄芩药渣组显著提高38.74%（P<0.05）。IL-4含量黄芩药渣组较对照组提高3.99%，差异不显著（P>0.05）；发酵黄芩药渣组较对照组显著提高38.28%（P<0.05），较黄芩药渣组显著提高32.97%（P<0.05）。

表5 发酵药渣添加剂对断奶仔猪血清免疫指标的影响

2.2 药理学毒性试验

2.2.1 临床症状与病理学观察

结果显示，对照组和试验组的ICR鼠精神状态、饮食欲、对外界反应能力未见明显的异常，各组鼠均无发病和死亡。对对照组和试验组的ICR鼠进行剖检，眼观未见内脏器官有明显的病理变化。

2.2.2 生长指标观察

试验结束，对ICR鼠称量体重、脏器重，计算各脏器指数，分析见表6。

由表6可知，试验组ICR鼠肝脏、心脏、肾脏、肺脏、脾脏指数与对照组之间无显著性差异（P>0.05），均处于正常范围。

表6 各脏器指数分析(%)

2.2.3 肝脏功能变化观察（见表7）

表7 谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）测定结果

试验结束后，采取血液分离血清，测定AST、ALT活性，结果见表7。

由表7可知，试验组数据与对照组相比差异不显著，都处于正常范围内，饲喂发酵药渣和发酵中药对ICR鼠的肝脏功能无显著毒副作用。

2.3 长期毒性试验

结果显示，连续给ICR鼠灌胃30 d，动物的皮毛、肤色、摄食、活动、尿、便等均无异常；动物的血常规，肝、肾功能等血液生化指标和动物的主要脏器指数均在正常范围，且正常动力无差异；病理组织学检查表明，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、气管、睾丸、卵巢等重要脏器无病理改变。停药14 d后检查以上各项指标均无明显毒性反应，表明无蓄积毒性。

3 讨论

研究表明，肠道微生物菌群在提供保护性肠道屏障，促进营养物质消化和代谢，同时在提高免疫力方面发挥着关键作用[18-20]。肠道微生物通过刺激肠道黏膜的正常发育，实现对断奶仔猪肠道黏膜免疫的调节作用[8，21]。益生菌可通过与致病菌竞争肠道黏膜表面结合位点，定植于肠道内，从而调节仔猪肠道微生物菌群的平衡，预防仔猪腹泻发生[22-24]。本研究利用益生菌发酵双黄连药渣作为饲料添加剂，发酵产物兼具中草药和益生菌的双重功效，具有酸香味道，更有利于仔猪采食；还能够提高仔猪肠道消化酶活性，促进小肠消化和吸收，降低蛋白质在大肠中的发酵，防止有害微生物的滋生，从而防止仔猪腹泻。饲喂结果显示，发酵黄芩药渣组仔猪肠道中乳酸菌数量和双歧杆菌数量分别可达4.16×108CFU/g和5.32×108CFU/g，显著高于对照组，其大肠杆菌数量显著低于对照组（P<0.05）。植物乳杆菌发酵黄芩废渣之后，能够将第一次浸提过程中未得到提取的成分和活性物质最大限度地转化释放，通过生物代谢使活性组分转化为活性物质，进而提高其抗病能力。

此外，研究发现黄芩药渣还能够降低应激反应、提高机体抗病力及免疫应答能力。仔猪血清免疫结果显示，血清中的IgG、IL-4水平较药渣组和对照组均有显著提高；与对照组相比较，发酵黄芩药渣组IgG含量显著提高42.08%（P<0.05），IL-4含量显著提高38.28%（P<0.05）。长期毒性试验显示，长期饲喂发酵药渣对小鼠各脏器无明显毒副作用，表明发酵药渣可作为饲料添加剂用于动物喂养。综上所述，黄芩药渣发酵后，能够改善动物肠道健康，促进动物生长发育，增强免疫力，能够在一定程度上填补饲料行业全面禁抗后预防仔猪腹泻方面的空白。在今后的研究中，发酵中药渣与动物肠道健康的互作机制值得进一步深入探究。

4 结论

经植物乳杆菌发酵的黄芩药渣作为饲料添加剂，能够有效降低仔猪的腹泻率，提高仔猪增重，有助于提高仔猪免疫力，调节仔猪肠道微生物菌群，为新型中药渣饲料添加剂的开发提供新的思路。