5个绵羊群体GDF9基因多态性与产羔数的关联分析

邵顺成，康晓龙，闫背背，张天闻，梁 鹏，邹诗凡，孟 科，荣 轩，强 浩，冯登侦，李新海

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750000）

生长分化因子9（Growth differentiation factor 9，GDF9）属于转化生长因子β（TGF-β）超家族卵母细胞衍生的生长因子。BODENSTEINER等[1]在1999年报道了绵羊GDF9基因的核苷酸序列，包含2个外显子和1个内含子。骨形态发生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）在卵母细胞中特异表达，通过阻止颗粒细胞凋亡来促进卵母细胞的发育，对卵泡发育及动物的排卵率有着重要的调控作用[2-3]。GDF9和BMP15氨基酸序列和蛋白质结构具有高度的同源性，它们在卵巢中的表达方式和功能也密切相关[4-5]。在绵羊中，BMP15和GDF9基因同时纯合突变可抑制卵泡的发育，但若2个基因杂合突变可导致排卵率增加[6]。研究表明，GDF9蛋白以旁分泌的方式影响卵丘细胞和颗粒细胞的功能，对卵泡形成和排卵的过程至关重要，同时还参与排卵[7]。在卵巢中，GDF9基因对颗粒细胞的增殖、分化和凋亡起到关键的调控作用[8]。研究表明，GDF9基因可作为绵羊多羔性状的候选分子标记[9-11]。目前，对于GDF9基因SNP与绵羊产羔数的相关性研究主要集中在GDF9编码区，其在绵羊中具有高度的品种特异性[12-13]。关于GDF9基因对羊繁殖性状的影响研究颇多，如TONG等[14]研究发现，蒙古羊GDF9基因g.46544883A＞G、c.1040T＞C和g.46547859C＞T 3个SNP可能是影响蒙古羊产羔数的优势位点；BI等[15]研究发现，绒山羊GDF9基因的2个错义突变SNP可影响山羊的产仔数；WANG等[16]对山羊GDF9基因45个SNP进行归纳分析，结果表明，在多种山羊品种中，3个错义突变SNP（A240V、Q320P和V397I）和3个同义突变SNP（L61L、N121N和L141L）与山羊的产羔数具有一定的关联性。同时，GDF9基因在山羊的多个组织中广泛表达，如卵巢、下丘脑、垂体、子宫等，但在卵巢中的表达最高，这也证实GDF9基因在生殖器官中可能起重要调控作用[17]。TANG等[18]报道，高产小尾寒羊的卵巢中GDF9基因的表达水平高于低产小尾寒羊，说明GDF9基因可能在小尾寒羊的产羔性能中发挥重要调控作用。赵茜等[19]研究发现，GDF9基因可调控绵羊卵丘细胞雌二醇、黄体酮等生殖激素的分泌，并影响相关激素受体基因的相对表达量。可见，对GDF9基因错义突变位点展开研究，寻找与产羔数具有关联性的多态位点尤为重要。

绵羊的繁殖性状在绵羊育种中具有很高的经济价值，但这种性状的遗传力很低，传统育种进程缓慢，通过分子标记辅助选择来探索和发现绵羊高繁殖力基因可以有效地提高其繁殖性能[20]。宁夏优质肉羊新品种（系）培育利用我国滩羊、小尾寒羊种质品种，以杜泊羊为主导品种，运用现代分子育种技术和常规育种技术相结合方法，挖掘小尾寒羊和杜泊羊的多胎特色基因，以期培育具备较高繁殖力的肉羊新品种。以杜柏羊、滩羊和小尾寒羊3个群体杂交后开展特色基因的挖掘研究，因群体间的遗传差异性较大，更容易筛选出差异显著的目标性状特色基因。鉴于此，以杜泊羊、滩寒羊、杂一代、杂二代和横交一代5个绵羊群体为研究对象，基于Ensembl数据库中已有的GDF9基因的错义突变位点，采用Sequenom Mass ARRAY®SNP技术对5个绵羊群体GDF9基因rs425223128、 rs597009987、 rs415699275 和rs160076408等4个位点进行检测，利用相关生物信息学分析软件对GDF9蛋白的理化性质、差异位点突变前后的蛋白质二级结构、蛋白质互作等进行分析与预测，以期为研究绵羊GDF9基因的生物学功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

共采集5个绵羊群体共768只绵羊的耳组织，其中有产羔数记录的599只（表1）。试验羊均为母羊，来自宁夏宇泊科技有限公司。同时记录各群体母羊的产羔季节、胎次与产羔数。

表1 试验羊群信息Tab.1 Test sheep information

1.2 基因组DNA提取

使用组织DNA提取试剂盒对绵羊耳组织样本DNA进行提取，DNA质量利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 基因分型

采用Mass ARRAY Assay Design 3.1软件设计检测GDF9基因4个位点的单碱基延伸引物和聚合酶链式反应程序。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对绵羊各基因位点的基因型频率、基因频率、期望杂合度（He）、观察杂合度（Ho）、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）等进行计算，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。利用SPSS25.0软件程序中一般线性模型对5个绵羊群体各基因型与产羔表型数据进行关联分析，其中，产羔数/产羔次数为每只羊的平均产羔数[21]。所有数据均以平均值±标准差表示。

1.5 生物信息学分析

采用ExPASy在线软件的ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）程序分析绵羊GDF9蛋白的理化性质[22]；使用SOPMA工具（http://npsa-prabi.ibcp.fr/npsa_sopma.htmL）分析GDF9蛋白的二级结构；运用STRING数据库(http://string-db.org/)构建与绵羊GDF9蛋白相互作用的蛋白质网络。

2 结果与分析

2.1 绵羊GDF9基因4个位点在5个群体中的分型结果

由图1可以看出，rs425223128和rs597009987位点均为纯合型TT，rs415699275位点为纯合型CC，rs160076408位点在5个群体中存在CC、TC、TT等3种基因型。

图1 绵羊GDF9基因4个位点的分型结果Fig.1 Typing results of four lociof GDF9 gene in sheep

2.2 GDF9基因在5个绵羊群体中的多态性分析

rs425223128、rs597009987和rs415699275位点均为纯合型，故不进行多态性及关联分析。由表2可知，rs160076408位点在5个群体间均为低度多态，除了在杂二代群体不处于Hardy-Weinberg平衡状态，在其他4个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表2 绵羊GDF9基因rs160076408位点群体遗传结构分析Tab.2 Analysis of population genetic structure of GDF9 gene rs160076408 locus in sheep

2.3 绵羊GDF9基因rs160076408位点与不同群体羊产羔数的关系

对GDF9基因rs160076408位点的不同基因型与5个群体的产羔数进行关联分析（表3），结果表明，杂一代群体TC基因型产羔数显著高于CC基因型（P＜0.05），说明rs160076408位点适用于杂一代绵羊群体多羔性状的选育。

表3 绵羊GDF9基因rs160076408位点各基因型与产羔数的关联分析Tab.3 Association Analysis of litter size and different genotypes at rs160076408 locusof GDF9 gene in sheep

［14］TONG B，WANG J，CHENG Z，et al.Novel variants inGDF9gene affect promoter activity and litter size in mongolia sheep［J］.Genes（Basel），2020，11（4）：375.

［15］BI Y，LI J，WANG X，et al.Two novel rare strongly linked missense SNPs（P27R and A85G）within theGDF9gene were significantly associated with litter size in shaanbei white cashmere（SBWC）goats［J］.Frontiers in Veterinary Science，2020，7：406.

［16］WANG X，YANG Q，ZHANG S，et al.Genetic effects of single nucleotide polymorphisms in the goatGDF9gene on prolificacy：True or false positive？［J］.Animals（Basel），2019，9（11）：886.

［17］YANG C X，ZI X D，WANG Y，et al.Cloning and mRNA expression levels ofGDF9，BMP15，andBMPR1Bgenes in prolific and non-prolific goat breeds［J］.Molecular Reproduction and Development，2012，79（1）：2.

［18］TANG J，HU W，DI R，et al.Expression analysis of the prolific candidate genes，BMPR1B，BMP15，andGDF9in small tail han ewes with three fecundity（FecBgene）genotypes［J］.Animals（Basel），2018，8（10）：166.

［19］赵茜，努日比娅姆·麦麦提托合提，宋玉坤，等.GDF9对绵羊卵丘细胞增殖的影响［J］.中国畜牧兽医，2020，47（10）：3289-3296.ZHAO X，NURIBIYAMU M，SONG Y K，et al.Effect of GDF9 on sheep cumulus cell proliferation［J］.China Animal Husbandry&Veterinary Medicine，2020，47（10）：3289-3296.

［20］ WILLIAMS J L.The use of marker-assisted selection in animal breeding and biotechnology［J］.Scientific and Technical Review，2005，24（1）：379-391.

［21］邹辉，瞿秋红，夏琴，等.努比亚山羊BMPR-IB基因多态性与其产羔性状的关联分析［J］.南方农业学报，2019，50（4）：860-866.ZOU H，QU Q H，XIA Q，et al.Correlation analysis between Nubian goatsBMPR-ⅠBgene polymorphism and its lambing traits［J］.Journal of Southern Agriculture，2019，50（4）：860-866.

［22］龙广丽，牟腾慧，刘洋，等.贵州地方白羽鸡种MSTN基因SNP位点快速筛查及其蛋白功能预测［J］.南方农业学报，2020，51（8）：1840-1848.LONGGL，MOUTH，LIUY，et al.Rapid screening and protein function prediction ofMSTNgene SNP sites in Guizhou local chicken breeds［J］.Journal of Southern Agriculture，2020，51（8）：1840-1848.

［23］VARNOSFADERANI S，OSTADHOSSEINI S，HAJIAN M，et al.Importance of theGDF9signaling pathway on cumulus cell expansion and oocyte competency in sheep［J］.Theriogenology，2013，80（5）：470-478.

［24］MONTE A，SANTOS J M，MENEZES V G，et al.Growth differentiation factor-9 improves development，mitochondrial activity and meiotic resumption of sheep oocytes afterin vitroculture of secondary follicles［J］.Reproduction in Domestic Animals，2019，54（9）：1169-1176.

［25］ZHANG Y，DU H，CHEN J，et al.Porcine growth differentiation factor 9 gene polymorphisms and their associations with litter size［J］.Genet Genomics，2008，35（3）：163-169.

［26］TORRECILHA R，MILANESI M，WADE C M，et al.Association of missense variants inGDF9with litter size in Entlebucher mountain dogs［J］.Animal Genetics，2020，51（1）：78-86.

［27］LOU Q，LI T，WU P，et al.Polymorphism identification inGDF9gene and its association analysis with reproduction traits in Jinghai yellow chicken［J］.Animal Biotechnology，2019，30（4）：332-341.

［28］LIU L B，CUI Z F，XIAO Q H，et al.Polymorphisms in the chicken growth differentiation factor 9 gene associated with reproductive traits［J］. BioMed Research International，2018，2018：9345473.

［29］JIA P，QINGLEI L，KAREN W，et al.Growth differentiation factor 9：Bone morphogenetic protein 15 heterodimers are potent regulators of ovarian functions［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（8）：2700.

［30］DURELL S R，BEN-NAIM A.Hydrophobic-hydrophilic forces in protein folding［J］.Biopolymers，2017，107（8）：23020.

［31］ DAVID A P，FREDERICK H.The hydrophobic moment and its use in the classification of amphiphilic structures（Review）［J］.Molecular Membrane Biology，2002，19（1）：1-10.

［32］ZHANG X Y，ZHANG L P，SUN W B，et al.Study on the correlation between BMPR1B protein in sheep blood and reproductive performance［J］.Journal of Animal Science，2020，98（5）：1-6.

［33］LI H X，XU H W，AKHATAYEVA Z，et al.Novel indel variations of the sheepFecBgene and their effects on litter size［J］.Gene，2021，767：145176.

［34］WANG W M，LIU SJ，LI F D，et al.Polymorphisms of the ovineBMPR-ⅠB，BMP-15andFSHRand their associations with litter size in two Chinese indigenous sheep breeds［J］.International Journal of Molecular Sciences，2015，16（5）：11385-11397.