烟草镰刀菌根腐病病原菌的鉴定及其对5种杀菌剂的敏感性分析

刘利佳，李芳芳，何 雷，彭玉富，丁永乐，孙聚涛

(1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2.河南省烟草公司，河南 郑州 450000；3.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450000)

烟草镰刀菌根腐病是一种严重的土传病害，在全国各烟区的发生率呈逐年上升趋势，据田艳艳等[1]调查结果显示，河南地区烟田发病率达到30%，对烟叶的产量和质量造成严重的影响[2]。因此，开展烟草镰刀菌根腐病的防治研究具有重要意义。

烟草镰刀菌根腐病病原菌的种类存在地域差异[2-3]。桑维钧等[4]研究发现，贵州省烟草镰刀菌根腐病的主要致病菌是茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌。陈高航[5]在湖北恩施研究发现，烟草镰刀菌根腐病的主要致病菌为尖孢镰刀菌。田艳艳等[1]等研究表明，河南地区烟草镰刀菌根腐病的主要病原菌为尖孢镰刀菌。目前，对烟草镰刀菌根腐病的防治以化学农药为主，一般采用卫福、恶霉灵、甲霜灵和克菌丹等药剂进行防治[6-8]。陈琳[6]测定了卫福、恶霜灵及五硝基苯胺对尖孢镰刀菌的抑制率，发现这3种药剂不能有效防治尖孢镰刀菌。陈志敏[7]对5种防治药剂的试验发现，5种杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌的毒力存在差异，世高和瑞毒脱对该病菌有较好的抑制效果，复配后相对防效最高为79.7%，而三唑酮和甲霜灵锰锌对烟草镰刀菌根腐病菌的抑制效果较差。陈长卿等[8]研究了克菌丹对烟草镰刀菌根腐病的防治效果，发现克菌丹的相对防效仅为46.75%，其抑菌效果显著低于精甲·恶霉灵。由于烟草镰刀菌根腐病病原菌寄主范围广、致病能力强且易变异，常用的化学药剂防治效果不佳。针对当前防治烟草镰刀菌根腐病的有效化学药剂较少和常用药剂防治效果不理想的现状，对烟草镰刀菌根腐病原菌进行分类鉴定并筛选高效抑制病原菌的杀菌剂具有重要意义。因此，对前期从河南省襄城县烟草镰刀菌根腐病发病烟株根部分离出的菌株NC-11进行鉴定，并比较5种杀菌剂对其菌丝生长的抑制率及抑制中浓度，筛选出毒力最强的杀菌剂进行田间验证，为生产上防治烟草镰刀菌根腐病提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株NC-11是2019年由河南农业大学烟草育种实验室从河南省襄城县烟草镰刀菌根腐病发病烟株根部分离出的菌株。

供试药剂：供试杀菌剂共5种，分别是金雷、亮盾、适乐时、国光健致、增威赢绿+易保。其中金雷、亮盾、适乐时有效成分及剂型分别为68%精甲霜·锰锌水分散粒剂(WG)、62.5 g/L精甲·咯菌腈悬浮种衣剂(FSC)和25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂（FSC），均由瑞士先正达作物保护有限公司生产；国光健致有效成分及剂型为30%精甲·恶霉灵水剂(AS)，由陕西先农生物科技有限公司生产；增威赢绿+易保有效成分及剂型为10%氟噻唑吡乙酮可分散油悬剂(OD)+68.75%恶酮·锰锌水分散粒剂(WG)，由美国杜邦公司生产[9-10]。

供试培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDB）、康乃馨叶片培养基（CLA）。

1.2 供试菌株NC-11的形态学鉴定、分子鉴定及致病力鉴定

1.2.1 形态学鉴定 将保存的菌株NC-11在直径90 mm的PDA培养基上活化，置于28℃生化培养箱中倒置培养5～7 d，观察其菌落形态。用无菌牙签挑取菌丝制成玻片，在10×40倍显微镜下观察NC-11的菌丝。取直径为5 mm的打孔器，经灼烧消毒后，沿菌落边缘均匀打制新鲜菌饼，在无菌操作台中分别接种至灭菌的PDB培养液和CLA培养液中，每150 mL培养液接种5个新鲜菌饼。封口后置于25℃、150 r/min的摇床上摇培3～5 d，以PDB培养液摇培后可得到以小型分生孢子为主的小型分生孢子培养液，以CLA培养液摇培后可得到以大型分生孢子为主的大型分生孢子培养液。用移液枪分别吸取20μL孢子培养液制成玻片，观察小型分生孢子形态和大型分生孢子形态[11-13]。

1.2.2 分子鉴定 采用试剂盒Solarbio Fungi Genomic DNA Extraction Kit提取供试菌株NC-11的DNA。以提取的DNA为模板，用鉴定镰刀菌的引物EF-1(3′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-5′)和EF-2（3′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-5′）进行PCR扩增。引物由河南尚亚生物技术有限公司合成。Marker为DL2000 DNA Marker,扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离。目的片段经DNA胶回收试剂盒回收纯化，并由河南尚亚生物技术有限公司测序。

1.2.3 致病力鉴定 选取长势一致的4～5叶期健康烟草幼苗（中烟100），将烟草植株根部用无菌剪刀剪去根尖制造伤口，然后将烟草植株根部在孢子浓度为1×106个/mL的NC-11孢子悬浮液中浸泡10 min，使其根部充分接触镰刀菌孢子，而后将烟草幼苗移栽进经高温灭菌过的无菌基质中培养30 d，以清水作为对照。30 d后将根部基质洗净，观察供试菌株NC-11的致病力。

1.3 菌株NC-11对杀菌剂的敏感性测试

1.3.1 制备菌饼 将保存的菌株NC-11在PDA培养基上活化，培养5～7 d。取直径为5 mm的打孔器，经灼烧消毒后，在菌落边缘均匀打制新鲜菌饼，备用。

1.3.2 生长速率测定 配制培养基时，将培养基浓度定容至标准培养基浓度的90%，再分别将5种供试杀菌剂用无菌水稀释成相应质量浓度（表1）的10倍母液。在无菌操作台中，待培养基冷却至50～60℃时，分别将杀菌剂母液与培养基以1∶9的比例轻轻混合均匀，配制成含不同质量浓度药剂的培养基，倒入培养皿中制备平板，平板冷却后即为药剂培养基。将制备的菌饼分别接种于不同质量浓度的含药平板的中心，28℃培养5 d，以十字交叉法测量各菌落直径。每种杀菌剂每个质量浓度（有效成分，下同）重复3次。采用SPSS统计软件分析并求得杀菌剂对NC-11菌丝生长的抑制率及毒力回归方程、相关系数、有效抑制中浓度（EC50）[11]。抑制率按照以下公式计算：

表1 药剂培养基有效质量浓度Tab.1 Effective mass concentration of pharmaceutical medium

抑制率=(对照菌落增长直径-处理的菌落增长直径)/对照菌落增长直径×100%。

以设定的质量浓度的对数为横坐标（x），抑制率概率值为纵坐标（y），求得毒力回归方程y=a+bx。

1.4 烟草镰刀菌根腐病的田间防效试验

根据1.3.2的测定结果，选择抑菌效果最好的杀菌剂进行田间防效验证。试验设置在河南省许昌市襄城县，选择采集分离菌株NC-11的病田进行烟草镰刀菌根腐病的田间防效试验，该田2019年镰刀菌根腐病发病较为严重且发病程度均匀。试验田块面积为2 668 m2，其中1 334 m2为不施用杀菌剂的对照组，另1 334 m2为施用杀菌剂的试验组，烟株行距为1.2 m、株距为0.5 m。2020年4月15日将烟苗移栽至大田，试验组分别于移栽后7、14、21 d用62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC以62.50 mg/L（有效成分质量浓度，下同）进行灌根，每棵烟株每次灌根1 L，对照组同期用等量清水灌根，并分别于移栽后7 d（施药前）和首次施药后16、31、46、57、77 d调查试验组和对照组的发病率及病情指数。调查采用五点取样法，每个点调查10株烟株，病情指数分级参考邱睿等[14]的分级标准。利用Excel进行数据分析，计算其发病率、病情指数、病情指数增长率和相对防效[13-14]。公式如下：

发病率=发病株数/总调查株数×100%；

病情指数=∑（各病级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100%；

病情指数增长率=（基数病情指数-施药后病情指数）/基数病情指数×100%；

相对防效=（对照区病情指数增长率-处理区病情指数增长率）/对照区病情指数增长率×100%。

2 结果与分析

2.1 供试菌株NC-11的形态学鉴定、EF序列测定及致病力鉴定结果

2.1.1 形态学鉴定结果 供试菌株NC-11在PDA培养基上菌丝扩展速度较快，通常3～7 d布满培养皿表面，菌落表面干燥，质地紧密，呈棉絮状或绒毛状，表面隆起或有气生菌丝，边缘呈波状或卷曲。菌落不透明，菌丝白色，随菌落扩展，菌落背面会产生红、紫、黄色等色素沉积在培养基上。小型分生孢子为卵圆形或椭圆形，多数为单细胞，少数为双细胞结构，大小为(5～12)μm×(2.5～3.5)μm；大型分生孢子为镰刀形，具3～5个隔膜，壁薄，呈纺锤形至锥状，两段尖，顶端有钩状结构，大小为(27～60)μm×(3～5)μm；厚垣孢子壁表光滑，间生或顶生（图1）。根据Booth关于镰刀菌属的分类标准[13,15]，NC-11符合尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）的形态特征。

图1 供试菌株NC-11的形态学鉴定Fig.1 Morphological identification of the tested strain NC-11

2.1.2 分子鉴定结果 以NC-11的DNA为模板，采用引物EF-1、EF-2扩增的PCR片段的电泳图谱（图2）显示，扩增出的片段大约700 bp。对扩增产物测序后，包含引物在内的片段长度为708 bp。通过与NCBI数据库中登录的尖孢镰刀菌BLAST比对发现，NC-11与芝麻尖孢镰刀菌（MN417202.1Fusarium oxysporium，中国）相似度较高。用MEGA 7.0软件构建系统发育树（图3）发现，NC-11与Fusarium oxysporium菌株MN417202.1聚为一支。

图2 EF引物扩增的供试菌株NC-11产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis pattern of the tested strain NC-11 amplified by EF primer

图3 供试菌株NC-11的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the tested strain NC-11

2.1.3 致病力鉴定结果 从图4可以看出，烟株接种供试菌株NC-11后生长受到明显抑制。烟株底脚叶变黄，植株矮化，并长出大量须根，根系发黄，根尖出现湿腐症状，整体呈镰刀菌根腐病发病特征。从根部发病部位可分离到与NC-11性状一致的培养物。说明所分离的菌株NC-11确能引起烟草镰刀菌根腐病。综合NC-11的形态学鉴定、分子鉴定及致病性鉴定结果，可以判定NC-11是烟草镰刀菌根腐病的病原菌尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporium）。

图4 对照及接种供试菌株NC-11的烟株形态对比Fig.4 Morphological comparison of tobacco between control and inoculation of the tested strain NC-11

2.2 不同杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌NC-11菌丝生长的抑制效果

由表2可见，5种供试杀菌剂对NC-11的菌丝生长均有不同程度的抑制作用，其抑制率随质量浓度增加呈增加趋势。其中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC不同质量浓度处理菌落直径均差异显著，且均较CK显著降低(P＜0.05)；68%精甲霜·锰锌WG和62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC不同质量浓度处理抑制率差异显著。对比5种杀菌剂不同质量浓度对NC-11的抑菌率，结果表明，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC的抑菌效果最好，当质量浓度为0.10 mg/L时，其抑制率达到46.64%，当质量浓度为500.00 mg/L时，抑制率达到97.27%，各质量浓度之间差异显著；其次为30%精甲·恶霉灵AS、25 g/L咯菌腈FSC，质量浓度为500.00 mg/L时抑制率分别可达63.21%、61.90%；68%精甲霜·锰锌WG的抑菌效果较差，质量浓度为500.00 mg/L时抑制率为56.50%，1 000.00 mg/L时抑制率才达到66.53%；10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%恶酮·锰锌WG复配使用后，质量浓度为1.00 mg/L时抑制率为18.45%。

表2 不同杀菌剂对NC-11菌丝生长抑制率及方差分析Tab.2 Inhibition rate of different fungicides on NC-11 mycelium growth and variance analysis

2.3 不同杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌NC-11的EC 50比较

供试杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌NC-11的EC50存在较为明显的差异（表3），表明各药剂对该病菌的抑菌效果存在差异。其中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC抑菌效果最好，EC50最小，仅为0.186 2 mg/L，毒力最强。对NC-11毒力较强的还有10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%恶酮·锰锌WG、30%精甲·恶霉灵AS、25 g/L咯菌腈FSC，其EC50分别为25.628 9、61.078 5、91.017 6 mg/L，抑菌效果较好。68%精甲霜·锰锌水分散粒剂的抑菌效果最差，EC50为203.152 2 mg/L。

表3 不同杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌的抑菌效果Tab.3 Bacteriostatic effect of different fungicides on tobacco Fusarium root rot

2.4 62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC对烟草镰刀菌根腐病的大田防效

62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC对烟草镰刀菌根腐病的大田防效见表4，未经62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC灌根处理的对照组田块烟株烟草镰刀菌根腐病的自然发病率整体均高于试验组田块。烟草生长至团棵期（首次施药后16 d）时，烟株镰刀菌根腐病的发病情况较轻，试验组的病情指数为4.40，略低于对照组（4.67），此时相对防效为40.00%；首次施药后31、46 d，烟株进入旺长期，试验组较对照组发病率出现明显降低，对照组发病率达到16.38%、20.67%，试验组发病率仅11.33%、11.96%，首次施药后46 d相对防效达72.69%；首次施药后57、77 d时，烟株进入成熟期，对照组自然发病率达到22.33%、24.13%，而经62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC灌根处理的试验组发病率仅12.45%、14.00%，较对照组明显降低，但此时相对防效为69.08%、66.90%。

表4 62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC对烟草镰刀菌根腐病的大田施药防治效果Tab.4 Field control effect of metalaxyl-M·fludioxonil 62.5 g/L FSC on Fusarium root rot of tobacco

3 结论与讨论

本研究对从河南省襄城县烟草镰刀菌根腐病发病烟株根部分离出的菌株NC-11进行形态学及致病性鉴定，结果表明，NC-11符合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)的特征[12-16]，采用EF引物进行分子鉴定，结果表明，该病原菌是尖孢镰刀菌。

通过5种杀菌剂对NC-11菌株的毒力测定得出供试杀菌剂的毒力回归方程、相关系数和EC50值，结果表明，供试杀菌剂中，62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC对烟草镰刀菌根腐病菌NC-11的抑制效果最好，其EC50较低（0.186 2 mg/L），且随着质量浓度的提高，对NC-11生长抑制作用增强，最高抑菌率达97.27%。其余4种杀菌剂的抑菌效果由高到低依次为10%氟噻唑吡乙酮OD+68.75%恶酮·锰锌WG、30%精甲·恶霉灵AS、25 g/L咯菌腈FSC、68%精甲霜·锰锌WG。62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC之所以抑菌率较高，是因为该药剂是由精甲霜灵和咯菌腈复配而成的杀菌剂，其中精甲霜灵的主要作用机制是通过抑制rRNA的合成而抑制病原菌在寄主体内发展。30%精甲·恶霉灵AS和68%精甲霜·锰锌WG同样有精甲霜灵的作用，但抑菌效果不佳，其原因可能与病原菌的抗药性提高有关[17-18]。而62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC由于精甲霜灵复配咯菌腈后，可能提高了尖孢镰刀菌菌株对药剂的敏感性[17-22]。

田间验证结果表明，精甲·咯菌腈FSC以质量浓度62.50 mg/L在移栽后进行灌根处理，首次施药46 d后相对防效达72.69%，而后防效逐步降低。首次施药77 d后相对防效为66.90%。这是因为尖孢镰刀菌致病能力受温湿度等因素影响较大，在河南省襄城县，烤烟生长进入烟叶成熟期时（7月下旬到8月上旬）正值高温高湿季节，有利于烟草镰刀菌根腐病菌的侵染，故造成62.5 g/L精甲·咯菌腈FSC对该病的防治效果有所降低。因此在实际应用中，应在7月上中旬补施药剂，以防止烟株生长后期镰刀菌根腐病的发生和发展。