25℃泡菜自然发酵过程中微生物菌群消长规律的研究

陆晓晴，祁 微，徐 晴，宋秀雯，何 星，周 佳，田宝霞

（淮阴工学院，江苏淮安 223003）

泡菜是以新鲜时蔬为基本原料，在乳酸菌、醋酸菌及酵母菌等的协同作用下进行厌氧发酵制成的[1]。从3 000 多年前的商周起，我国泡菜就已经初具雏形[2]，且一直以来深受百姓喜爱。自1900 年开始，国内外出现了关于发酵蔬菜中微生物的系统性研究。Pederson[3]率先对发酵泡菜的微生物做出研究，首次提出了蔬菜发酵启动菌的概念，最后证实该菌是肠膜明串珠菌。方心芳[4]认为，泡菜自然发酵时，多种微生物协同合作完成发酵，乳酸菌主攻产酸。吴云[5]从市售传统发酵泡菜中筛选出15 株乳酸菌，研究发现，植物乳杆菌产生低pH 且对胆盐具有较强耐受力；添加植物乳杆菌用于发酵，可缩短泡菜发酵时间，降低胆固醇含量。Albury等[6]以酸黄瓜为自然发酵原料，通过实验发现，酸黄瓜发酵前期以异型发酵为主，后期以同型发酵为主。Sanchez等[7]以橄榄为研究对象，将自然发酵时的理化指标、菌相消长情况与以戊糖乳杆菌为发酵剂时的情况做比较，发现自然发酵速率低于接种发酵，但主要酸产物最终达到平衡。Yildiz 等[8]研究了多种菌相协同发酵包菜的情况，发现当多种菌样交联时会相互刺激，加快发酵进程。

尽管我国泡菜产量高，技术水平也越来越成熟，但缺乏足够的基础研究，且对于泡菜发酵过程中多菌种代谢机制尚不明确，这阻碍了发酵生产工艺的发展进程，因此亟需更多关于蔬菜发酵中微生物菌群消长代谢规律的深入研究。本文观察了从25℃发酵泡菜中微生物的生长情况，探索了包菜在特定温度下发酵，微生物菌系及其动态规律，以期准确掌握发酵过程中泡菜制品的微生物代谢活动，为提高泡菜质量发酵提供依据，同时也为发酵蔬菜的工业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜包菜、干辣椒、野山椒、去皮生姜、泡菜盐、老冰糖，均购自本地超市。

考马斯亮蓝G-250 试剂，北京康为世纪生物科技有限公司；DNS 试剂，北京生东科技有限公司；氢氧化钠、吐温-80，上海久亿化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；牛血清蛋白，南京奥多福生物科技有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司。琼脂，德国BioFroxx；牛肉浸膏，国药集团化学试剂有限公司；M17 培养基，青岛高科技工业园海博生物公司；麦康凯琼脂培养基，杭州微生物试剂有限公司；虎红琼脂培养基，江苏宜兴市永信生物有限公司；以上试剂均为生化试剂。

1.2 仪器与设备

雷磁PHS-3E 型pH 计，上海精密科学仪器有限公司；250-D 型光照培养箱，国华电器有限公司；unico UV-2100 紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；艾本德5804R 台式高速大容量离心机，上海珂淮仪器仪器有限公司；JA2603B 电子天平，上海精密科学仪器有限公司；DH-6000AB电热恒温培养箱，金坛市城东科辉仪器厂；SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台，苏州净化有限公司；HYG-C型多功能摇床，苏州市培英实验设备有限公司。

1.3 培养基

本实验中所使用的培养基主要有M17 培养基、MRS培养基、麦凯康琼脂培养基、虎红培养基、GYC 培养基，培养基配方如表1 所示。

表1 培养基的配方Table 1 Formulation of culture medium

1.4 泡菜的制作

将包菜洗净，晾干后撕成块状备用，按照表2 中的配方配制，密封后放入25℃恒温保温箱中发酵，整个操作过程中要求不能进入生水。

表2 不同配方的原料用量Table 2 Raw material consumption of different formulations

1.5 测定指标与方法

1.5.1 pH 值和酸度的测定采用pH 计直接测定泡菜发酵液的pH，测量3 次后取平均值。酸度的测定采用酸碱滴定法测定。

1.5.2 可溶性蛋白含量的测定

采用牛血清蛋白绘制标准曲线。称取约10 g 发酵泡菜于研钵中充分研磨后，准确称取1 g 于离心管中，加入3 mL 去离子水，3 500 r/min 离心15～20 min，取上清液1 mL 作待测样品，测定并记录A595。根据标准曲线，计算出可溶性蛋白含量。

1.5.3 亚硝酸盐含量的测定

亚硝酸盐含量采用盐酸萘乙二胺比色法测定[9]。

取9 支洁净干燥的50 mL 比色管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的5 g/mL 亚硝酸钠标准溶液，然后每管加对氨基苯磺酸溶液2 mL、盐酸奈乙二胺溶液1 mL，用去离子水定容至50 mL，振荡摇匀，待15 min 后，0 号管作空白对照，在538 nm 波长下比色，绘制标准曲线。

称取10 g 左右发酵泡菜于研钵中充分研磨后，准确称取5 g 于50 mL 烧杯中，加入10 mL 去离子水、12.5 mL硼砂饱和溶液混合均匀，用150 mL 去离子水将样品匀浆液洗入250 mL 容量瓶中，80℃水浴20 min。取5 mL 亚铁氰化钾溶液于容量瓶中，振荡，再加入5 mL 乙酸锌溶液，充分搅拌混匀，使蛋白质沉淀。加去离子水定容至250 mL，摇匀，待30 min 后过滤，将初次过滤得到的滤液废弃，随后的滤液作为样品，测定其中的亚硝酸盐含量。

1.5.4 还原糖含量的测定

还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定[10]。

1.5.5 微生物计数

采用稀释平板计数法进行各菌相的计数[11]。将每日无菌取样的包菜发酵液1 mL 于灭菌干燥试管中，再加入9 mL 无菌生理盐水混匀后进行梯度稀释，每个稀释度涂布三个平板，计数取平均数。用于检测乳酸球菌、乳酸杆菌、肠道杆菌的M17、MRS、麦康凯培养基于37℃培养48 h；用于检测酵母菌与醋酸菌的虎红和GYC 培养基于30℃培养48 h。

1.6 数据处理

采用Origin 9.0 数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 不同配方理化指标的测定结果

检测了实验中3 个不同配方下的pH 值以及还原糖、可溶性蛋白和亚硝酸盐含量，具体结果见表3（见上页）。

表3 不同配方的理化指标Table 3 Physical and chemical indexes of different preparations

经对比发现，配方1 中pH 值最低，还原糖、可溶性蛋白含量相对较高，亚硝酸盐含量居中。配方2 中亚硝酸盐含量最高，还原糖含量最低。配方3 中亚硝酸盐含量最低，但pH 值最高。综合口感与气味，按配方1 制作出来的泡菜样品香味最纯正浓郁，爽脆程度也最佳；从健康角度来说，配方1 制作出的泡菜样品亚硝酸盐含量远低于我国亚硝酸盐安全含量的国家标准GB2714—2003《酱腌菜卫生标准》规定的亚硝酸盐残留量不得超过20 mg/kg[12]，健康程度较高。综合考虑下，将配方1 确定为最佳配方，以配方1 制作的泡菜进行后续的理化指标检测。

2.2 pH 和酸度的变化

pH 值和酸度变化是泡菜自然发酵过程极为关键的特性参数，影响微生物数量及其代谢物活动[13-15]。如图1所示，随着发酵时间的延长，pH 值逐渐下降，酸度上升，最后都趋于稳定。pH 的初始值为6.35，酸度的初始值为0.01%，在0～3 d 时，pH 值下降速度较快，而3～6 d 时，pH 值下降开始缓慢并逐渐趋于稳定，酸度也趋于稳定。发酵完成时，pH 为3.8，可滴定酸度为0.6%。

图1 25℃泡菜自然发酵过程中pH 值和酸度的变化Fig.1 Changes of pH and acidity of pickles during natural fermentation at 25℃

2.3 可溶性蛋白含量的变化

可溶性蛋白质在发酵过程中被分解成氨基酸等物质，影响泡菜的色泽和风味[15]。泡菜在25℃恒温箱中自然发酵时可溶性蛋白含量变化如图2 所示。由图可知，在整个发酵过程中，泡菜的可溶性蛋白含量不断下降，最后趋于平稳。在发酵第1 天，可溶性蛋白含量急剧下降，由最初的2.232 mg/mL 降至0.345 mg/mL，随后几天可溶性蛋白持续下降，但速度明显减缓，逐渐到达一个稳定状态，到发酵第6 天时只有0.040 mg/mL。

图2 25℃泡菜自然发酵过程中可溶性蛋白含量的变化Fig.2 Changes of soluble protein content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.4 亚硝酸盐含量的变化

一般来说，较高含量的亚硝酸盐也会存在于新鲜的蔬菜中，因为吸收硝酸盐是蔬菜生长中合成所需植物蛋白的必经之路。由图3 可以看出，泡菜从入瓶开始，亚硝酸盐含量为7.6 mg/kg，经过1 d 后到达最高峰，为12.7 mg/kg；之后亚硝酸盐含量开始下降，在4～6 d 时，亚硝酸盐几乎呈直线下降，最后降至0.78 mg/kg。可见，泡菜在25℃恒温箱中自然发酵时，亚硝酸盐含量处于安全状态，并未超标，在发酵末期亚硝酸盐较低，适宜食用。

图3 25℃泡菜自然发酵过程中亚硝酸盐含量的变化Fig.3 Changes of nitrite content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.5 还原糖含量的变化

泡菜在25℃恒温箱中发酵时还原糖量变化如图4所示。从图中可以看出，25℃泡菜自然发酵中还原糖含量总体呈下降趋势。0～1 d 时，还原糖下降速度较快，从初始值4.99 mg/g 降至3.37 mg/g；2～4 d 时，由3.06 mg/g降至2.58 mg/g，可见下降速度明显减缓。5～6 d 时，还原糖含量处于一个相对稳定的状态，达到2.52 mg/g，此时微生物代谢过程趋近停止。

图4 25℃泡菜自然发酵过程中还原糖含量的变化Fig.4 Changes of reducing sugar content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.6 25℃泡菜自然发酵中微生物菌数的变化

25℃泡菜自然发酵过程中乳酸球菌、乳酸杆菌、酵母菌、霉菌、醋酸菌和大肠杆菌的菌数变化见图5。

图5 25℃泡菜自然发酵过程中微生物菌数的变化Fig.5 Changes of microbial count of pickles during natural fermentation at 25℃

由图5 知，发酵过程中未检测到霉菌的存在。各微生物的生长曲线显示，除大肠杆菌，所有被检测微生物的对数生长期均出现在发酵第1 天，大肠杆菌对数生长期持续到发酵第2 天，乳酸球菌、乳酸杆菌和醋酸菌的生长峰值均出现在发酵第3 天，而酵母菌和大肠杆菌生长峰值出现在发酵的第2 天，4 d 后所有微生物均处于衰退期；从菌的数量来看，在峰值阶段乳酸球菌、乳酸杆菌和醋酸菌的菌数为8～9 lg（CFU/mL），而酵母菌和大肠杆菌的菌数为4～6 lg（CFU/mL），发酵4 d 后乳酸球菌、乳酸杆菌、醋酸菌、大肠杆菌和酵母菌的菌数分别为8、7～8、6～7、3～4、3 lg（CFU/mL）。由此可见，发酵过程中乳酸球菌、乳酸杆菌和醋酸菌处于绝对优势，属于优势菌，在发酵过程中发挥了主要作用。乳酸菌和醋酸菌在影响发酵速度和泡菜口感方面起到了至关重要的作用。发酵过程也发现了有害菌大肠杆菌，尤其在发酵的前3 d 内，其菌数最高时可达到6 lg（CFU/mL），而当发酵4 d、pH 值降低至4 以下后，大肠杆菌菌数持续快速下降，发酵5 d 后菌数降低至接近3 lg（CFU/mL），说明从有害微生物的角度看，随着发酵pH 值的下降，泡菜的安全性在升高。

3 讨论

本研究研究了25℃包菜自然发酵过程中生理变化情况，初步掌握了酸度、还原糖、亚硝酸盐、可溶性蛋白以及乳酸杆菌、乳酸球菌、醋酸菌等微生物的变化规律。发酵后第1 天可溶性蛋白含量、亚硝酸盐含量、还原糖含量、发酵细菌数、乳酸球菌数、乳酸杆菌数、酵母菌数，以及醋酸菌数的变化速率均为最快。这表明本研究条件下，发酵初期是微生物快速繁殖代谢最为快速、泡菜原材料生化反应最为剧烈的阶段。由微生物的生长速率可以看出，第1 天可溶性蛋白含量和还原糖含量主要与发酵中微生物的快速代谢有关；同时，泡菜盐产生的高渗作用使得胞外渗透压大于胞内渗透压，导致泡菜内大量可溶性蛋白外渗流失，蔬菜组织细胞的衰亡导致大量蛋白酶的分泌，致使可溶性蛋白迅速降解。

随着发酵的进行，pH 持续下降，第4 天开始pH 下降至4 以下，可溶性蛋白含量和还原糖含量降至稳定的水平，而被检测微生物的生长处于衰退期，即微生物的数量处于下降阶段。这表明，随着发酵的进行，微生物的代谢消耗发酵容器中的氧气，使得发酵趋向厌氧发酵，微生物将剩余的糖代谢并分泌有机酸，造成pH 下降和酸度上升，当pH 下降至4 以下后，绝大多数的微生物代谢活动受到抑制并进入衰退期，剩余的可溶性蛋白和还原糖维持在一个较为稳定不变的水平。

在发酵前期，泡菜的pH 较高，腐败细菌的生命活动不能被有效控制，由细菌产生的硝酸还原酶会还原硝酸盐，生成亚硝酸盐[16]。泡菜中的酚类物质与VC 也将亚硝酸盐类还原成硝酸盐，但是生成亚硝酸盐速率仍大于其被还原率，所以第1 天亚硝酸盐处于上升期。24 h 后微生物发酵活动增强，乳酸菌变为第1 优势菌，主导了发酵，泡菜瓶内pH 降低，逐渐抑制有害菌的生命活动。此时硝酸盐还原力也不如发酵前期，亚硝酸盐生成量降低，发酵液中的酸或酶类物质将会分解已存在的亚硝酸盐，使整个过程中亚硝酸盐变化曲线呈现“抛物线”形态。

由发酵过程中的pH 值、酸度、还原糖、可溶性蛋白以及微生物数量的变化规律可见，发酵4 d 后，即pH 值低于4 以后，进入发酵的相对稳定期，乳酸菌数量最多，其余依次为醋酸菌、肠道杆菌和酵母菌。在蔬菜发酵食品中适量的醋酸菌的存在是有利的，醋酸菌带来的醋酸联合乳酸赋予了泡菜独特的香气。发酵4 d 时，pH 值低于4 以后，有害菌的数量快速下降，同时亚硝酸盐的浓度也进入快速下降期。说明，兼顾食用的安全性和口感，本研究中25℃包菜自然发酵至少4 d 是比较合适的。

4 结论

研究发现，泡菜在25℃恒温箱中自然发酵早期是微生物快速繁殖的主要时期，发酵前3 d 各微生物分别达到各自的数量峰值，pH 值、还原糖与可溶性蛋白含量都是处于不断下降状态；在发酵pH 值低于4 以后，还原糖与可溶性蛋白含量逐渐趋于较低的稳定水平，亚硝酸盐含量快速下降，微生物的增长都处于衰退期；整个发酵过程中乳酸球菌、乳酸杆菌、醋酸菌、酵母菌、肠道杆菌数量有差别，未检测到霉菌，数量上总体是乳酸菌＞醋酸菌＞细菌＞肠道杆菌＞酵母菌＞霉菌。乳酸菌又分为球菌和杆菌两类，球菌数量上先高于杆菌，而后在发酵中被杆菌超过，两者在最高峰时都达到了8～9 lg（CFU/mL）。醋酸菌数量在峰值时达到8 lg（CFU/mL），略低于乳酸菌，可见乳酸菌和醋酸菌在25℃泡菜发酵中是重要的优势微生物，在泡菜的整个发酵过程中发挥了重要作用，也是影响泡菜风味和口感的重要调控点。此外，控制发酵pH 值达到4 以下对于保证泡菜的安全性也是一个重要的步骤。