HS-SPME/GC-MS 分析美味猕猴桃中的风味物质

朱云琦，董官勇，刘明春*

（1.四川大学生命科学学院，四川成都 610064；2.四川省鑫源圣果农业有限公司，四川什邡 618400）

果实中，酸味、甜味和香味共同构成果实的风味品质，糖、酸是决定果实内在品质的重要因素，而香味是人们对果实感官品质评价的重要因素。植物的花朵、果实、叶片、根茎等组织通过初生代谢和次生代谢合成数以千计的具有亲脂性的小分子化合物[1]，主要分为醇类、酯类、醚类、醛类和萜类等，以其各自专有的气味综合表现为植物的独特香气[2]。至今水果的香气成分已被鉴别出2 000多种，但主要的香气成分各不相同[3]。Young 等[4]在收获期测量了苹果香气变化，主要香气成分为乙酸异戊酯（Isoamyl acetate）。涂正顺等[5]对‘魁蜜’和‘早鲜’两种猕猴桃果实香气成分进行分析，从中检测出26 种和44 种香气物质，主要香气物质仅有2-己烯醛（2-hexenal）、(E)-2-己烯醛等7 种物质对香气有贡献。

果实挥发性香气中的重要物质包括支链脂肪族醛、酮、醇和酯类等，而脂肪酸是形成此类物质的重要前体物质。脂氧合酶通过识别不饱和脂肪酸（如亚油酸和亚麻酸）上的1,4-异戊二烯结构进行氧化催化反应，最终形成过氧羟基脂肪酸[6]。大多数果实都能将过氧羟基脂肪酸转化为醇类物质，然后经过一系列酶类如乙酰基辅酶A 和乙醇脱氢酶（ADH）、氢过氧化物裂解酶（HPL）的催化作用将醇类物质转化为醛类或酯类物质[7]。脂肪族支链和芳香族的挥发性香气成分通常呈果香型或脂香型，大多数来源于氨基酸代谢途径[8]。支链酮酸作为重要的代谢途径中间物质可与辅酶A 生成酰基辅酶A，然后在醇酰基转移酶（AAT）作用下生成酯类物质[9]。萜类化合物可参与植物体内重要的生理过程，大量研究表明，萜类物质由五碳前体物质在萜类合成酶（TPS）的作用下反应生成半萜类、单萜类、倍半萜类和双萜类复合物，而这些物质所需的底物分别为二甲基烯丙基二磷酸、牻牛儿基二磷酸（GPP）、法呢基二磷酸（FPP）、牻牛儿酰牻牛儿基二磷酸（GGPP）。

我国作为猕猴桃属植物的原产地，为实现猕猴桃产业的多元化，野生猕猴桃种质资源的研究和选育一直是研究者的主要方向，而在优质猕猴桃育种材料的研究中，挥发性香气物质是衡量猕猴桃果实口感和风味品质的重要物质之一。本文以三种优质美味猕猴桃栽培品种‘秦美’‘华美’‘徐香’为对照，对三种美味野生猕猴桃材料‘kvf54’‘kvf6’以及‘鑫美’采用GC-MS 分析做香气物质间的对比，探究了不同材料间香气成分的差异，为猕猴桃的选育提供重要的基础材料，同时为美味猕猴桃的果实质量与品种评价、分子辅助育种方法提供依据，对优质猕猴桃的品种选育和猕猴桃商品化生产、推动猕猴桃产业的发展有积极作用。

1 材料与方法

1.1 样品及处理

实验所需品种与材料均由四川省什邡市凯维孚公司提供，采摘于四川省什邡市下院村凯维孚猕猴桃基地。

本实验所用美味猕猴桃包括以下三个对照品种：‘秦美’‘华美’和‘徐香’；三个筛选材料：‘kvf54’‘kvf6’和‘鑫美’。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

植物RNA 提取试剂盒，成都百菲特科技有限公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反转录试剂盒，Vazyme 公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 试剂盒，BIO-RAD 公司。

1.2.2 仪器与设备

手动SPME 进样器与手动萃取头，SUPELCO 公司；气质联用仪（GCMS-QP2010），Shimadzu 公司。

1.3 方法

将每个品种的果实采摘后经冷库（1℃）处理一个月后，去皮、切碎、混合，进行SPME-GC-MS 分析，重复3次。另将剩余果实液氮速冻后用于提取RNA 以及反转录实验。

1.3.1 SPME 条件

准确称取混合物5 g 放于20 mL 的顶空瓶内密封。使用SPME 进样器与手动萃取头刺入顶空瓶后置于50℃恒温水浴锅中萃取40 min，结束后取出。

1.3.2 GC 条件

将萃取结束后的微萃取头置于GC-MS进样口，250℃解析3 min 后通过GC-MS 进行香气成分的分析[10-12]。色谱柱为Rxi-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱；载气源为氦气，载气流量为1 mL/min；进样口温度为230℃；不分流进样；升温程序为以6℃/min 的速率由40℃升至280℃；解析时间为5 min。

1.3.3 MS 条件

EI 离子源；电力电压为70 eV；离子源温度200℃；接口温度220℃；四级杆质谱温度为150℃；倍增器电压1 200 eV，发射电流为34.6 A；质量扫描范围（m/z）为20～500。

1.3.4 结果分析

实验结束后，结果分析采用计算机检索以及对照标准图谱库（NIST 05）后导出PDF 格式的文档，然后根据保留时间并结合相关的参考文献，以此确定主要的香气成分，通过归一化积分法计算各个香气成分的相对含量，结果以“平均值±标准差”表示。

1.4 果实香气成分相关基因表达

参考文献设计引物（Actin[13]、AdLox1-6[14]、AcTPS1[14]、AcATs16[14]）以Actin作为内参基因，对猕猴桃果实香气成分相关基因进行定量PCR 检测。实验结束后，计算各基因相对表达量，计算公式见式（1）（2）。

式中，ΔCTn-每个基因的CT 值减去Actin的CT 值；ΔCT1-作为选择其中任意一个ΔCT作为参照；Exp-相对表达量。

2 结果与分析

根据GC-MS 结果分析（见下页表1），从6 个美味猕猴桃品种和材料中鉴定主要挥发性物质50 种，其中酯类18 种、醇醛类16 种、萜类7 种，‘秦美’‘华美’‘徐香’‘kvf54’‘kvf6’‘鑫美’中检测到21、26、18、26、23、26 种主要香气物质。

表1 不同猕猴桃果实香气成分GC-MS 分析结果Table 1 GC-MS analysis results of aroma components of different materials of kiwifruit

2.1 酯类物质

‘秦美’‘华美’‘徐香’分别含有8、10、8 种主要酯类化合物，丁酸乙酯是这三种猕猴桃共有的化合物，相对含量分别为10.1%、36.89%、0.92%。‘kvf54’‘kvf6’‘鑫美’分别含有9、10、8 种主要酯类化合物。丁酸丁酯是这6 种美味猕猴桃品种共有的酯类化合物，相对含量分别为‘秦美’0.1%、‘华美’0.24%、‘徐香’0.27%、‘kvf54’0.12%、‘kvf6’0.15%、‘鑫美’1.37%。

2.2 醇醛类物质

‘秦美’‘徐香’中主要醇类物质有4 种，相对含量较高，分别为34.81%和20.96%；‘华美’‘kvf54’中主要醇类物质有6 种，相对含量分别为14.13%和2.05%；‘kvf6’主要醇类物质有5 种，相对含量为1.8%；‘鑫美’主要醇类物质有8 种，相对含量为5.3%。反式-2-顺式-6-壬二烯-1-醇是‘秦美’‘华美’‘徐香’共有的醛类物质，相对含量分别为0.25%、0.15%、0.14%。

续表1

‘秦美’‘华美’‘kvf54’‘kvf6’中主要醛类物质有3种，相对含量分别为0.78%、1.94%、1.39%、0.64%，且‘秦美’和‘华美’主要醛类物质相同，为正戊醛、异戊醛和壬醛；‘徐香’和‘鑫美’中主要醛类物质有2 种，相对含量分别为0.89%、1.42%。

2.3 萜类物质

‘秦美’‘徐香’‘kvf6’‘鑫美’中主要萜类物质有3种，相对含量分别为1%、5.95%、1.04%、5.3%，2-丁烯是这四种美味猕猴桃共有的萜类化合物，相对含量分别为0.1%、1.15%、0.15%、4.74%；‘华美’‘kvf54’中主要萜类物质有4 种，相对含量分别为4.05%、0.8%，1,3-环戊二酮、芳樟醇是这两种美味猕猴桃材料共有的萜类化合物；芳樟醇是6 种美味猕猴桃材料共有的萜类化合物，相对含量分别是0.8%、0.45%、4.63%、0.08%、0.8%、0.43%。

2.4 美味猕猴桃后熟过程香气合成相关基因表达量

如图1（见下页）所示，以‘徐香’为对照，AdLox1、AdLox4、AdLox5在‘kvf54’中表达量显著性上调2.18 倍、4.77 倍、4.01 倍，但AdLox6、AcTPS1在‘kvf54’中表达量低于‘徐香’；‘华美’中AdLox1、AdLox2、AdLox6、AcTPS1与AcAT16的表达量均低于‘徐香’，且AdLox6的表达量显著低于‘徐香’，AdLox3在‘华美’中的表达量是唯一高于‘徐香’的，且差异显著，表达量相差2.75 倍；‘鑫美’中AdLox5、AcAT16基因表达量显著高于‘徐香’，分别高5.89 倍和5.34 倍，其余基因的表达量除AdLox2在‘鑫美’中低于在‘徐香’中且无显著性差异外，均与在‘徐香’中表达量持平；AdLox1、AdLox2、AdLox3、AdLox5、AdLox6在‘kvf6’中表达量显著上升4.4 倍、3.37 倍、3.35 倍、7.27倍、1.61 倍，同时，‘kvf6’中AcTPS1与AcAT16基因表达量也比在‘徐香’中高2.5 倍、7.8 倍，AdLox4在‘kvf6’中与‘徐香’相比并无显著性差异；‘秦美’中AdLox3、AdLox6与AcTPS1的表达量相比‘徐香’显著提高3.83 倍、1.51 倍、2.39 倍，AdLox1、AdLox4、AdLox5、AcAT16在‘鑫美’中的表达量低于‘徐香’，但无显著性差异，其余基因的表达量均与在‘徐香’中的无明显差异。

图1 美味猕猴桃果实后熟过程中果实香气合成相关基因表达量Fig.1 The expression of genes related to fruit aroma synthesis during the ripening of kiwifruit

3 讨论与结论

香气物质含量是影响猕猴桃后熟过程中品质与口感的重要因素[15]，国内外研究猕猴桃香气成分的报道较多[16]。因为猕猴桃品种或时期的不同，挥发性物质包括酯类、醇醛类和萜类化合物各自的风味物质含量也大不相同[17]。研究测定了6 种猕猴桃后熟过程中的挥发性成分，不同材料之间挥发性物质各不相同。AdLox1-6、AdADH1、AdADH2、AcTPS1与AcAT16的表达量也在不同品种间存在差异，与酯类、醇醛类和萜类化合物含量存在一定的相关性。

研究发现，在美味猕猴桃中亚油酸、亚麻酸在LOX催化作用下产生C6、C9 醛后，在乙醇脱氢酶（ADH）的作用下形成醇类物质后，可经酰基转移酶（AAT）的催化最终形成酯类物质[18]。系统发育分析生成已知植物LOX 家族的成员可以分为两个主要的集群组，第一组9-LOX（促进植物器官发育和果实成熟），包含AdLox2和AdLox5，第二组13-LOX（参与合成六碳醇类、醛类）[14]。本实验结果表明，‘kvf54’与‘徐香’相比，AdLox4表达量具有显著的增加，且增加幅度大，GC-MS 分析结果也显示‘kvf54’具有比‘徐香’更多含量的醛类物质；‘kvf6’和‘鑫美’中AdLox5的表达相比于‘徐香’而言显著上调，GC-MS 分析结果显示‘鑫美’具有比‘徐香’更多含量的醛类物质，但是‘kvf6’醛类相对含量较少，原因可能是还有其他Lox基因在‘徐香’中上调表达导致；‘秦美’‘华美’中AdLox3相比于‘徐香’的表达量上调更加明显，醛类物质相对含量也多于‘徐香’。

猕猴桃果实软化过程中,酯类含量增加[5]，前人报道发现AcAT16参与果实中酯类的合成[19]。‘鑫美’和‘kvf6’中酯类相对含量较高，酯类合成相关基因AcAT16在‘鑫美’以及‘kvf6’中表达具有显著性差异，说明在两种材料果实采摘后会大量合成酯类物质；‘秦美’‘kvf54’‘华美’和‘徐香’中酯类相对含量较少，AcAT16的表达量与对照相比也无显著性差异。萜类物质对植物的生长发育有很重要的作用，大量研究表明萜类物质是由TPS 催化五碳前体物质生成，其中关键酶类包括3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A 还原酶（HMGR）和脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶（DXR）[20]。GC-MS 结果表明，三种美味猕猴桃果实均检测到特征性萜类香气物质桉油精，研究报道桉油精在拟南芥中的生物合成推测是由AcTPS1基因调控的[21]。‘秦美’与‘鑫美’中检测到桉油精成分，AcTPS1表达量相对‘徐香’上调幅度较小。‘华美’中检测到桉油精成分，但AcTPS1与‘徐香’并无显著性差异，‘kvf6’中AcTPS1表达较高，但并未检测到桉油精成分，原因可能是萜类化合物含量还可以受HMGR、DXR 这两种酶的调控基因表达影响。