miR-148a靶向STAT3对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗敏感度的增强作用

汤良君，孙艳，张晓红，盛少琴

0 引言

宫颈癌是全球常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来发病率逐渐升高，且呈年轻化趋势发展[1]。目前，手术前后辅助化疗被认为是治疗宫颈癌有效的治疗方法之一，顺铂作为化疗的常用药物，在宫颈癌新辅助化疗方案中作为基础药物被广泛应用，然而，顺铂具有的肾、耳、血液、胃肠道等不良反应限制了化疗效果[2-3]。因此，寻找可增强宫颈癌顺铂敏感度的基因靶点药物，对降低顺铂用量、减轻不良反应具有重要的应用价值。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类小分子非编码单链RNA，通过从转录后水平调控靶基因表达，广泛参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡等过程[4]。研究发现，肾癌、乳腺癌等多种类型癌细胞的化疗敏感度均与miR-148a表达相关[5-6]，但miR-148a与宫颈癌顺铂耐药的关系尚不明确。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）参与宫颈癌的发生发展，抑制STAT3通路可提高宫颈癌顺铂敏感度[7]。miRTarBase数据库预测发现，STAT3是miR-148a的潜在靶点，其靶向关系在非小细胞肺癌中已有研究，但在宫颈癌中尚无定论[8]。HeLa细胞是宫颈癌细胞中最为稳定且增殖迅速的细胞系，故本研究将通过调控miR-148a表达，探讨miR-148a靶向STAT3对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗敏感度的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人HeLa细胞（货号：HZ-H496）购自美国ATCC细胞库；胎牛血清（货号：0025）购自美国ScienCell公司；顺铂（货号：D8810）购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM培养基（货号：KL-P0032）购自德国Merck/Sigma公司；Lipofectamine 2000转染试剂（货号：11668019）购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR（qRTPCR）试剂盒（货号：K1002S）、pGL3-basic vector（货号：E1751）购自美国Promega公司；miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor、miR-148a inhibitor及miR-148a、STAT3、U6、β-actin引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成；MTT溶液（货号：N/A-896）购自美国AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（货号：S0185）购自哈尔滨新海基因检测有限公司；p-STAT3抗体、STAT3抗体、CyclinD1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Cleaved caspase-3抗体、GAPDH抗体、羊抗兔lgG（货号：ab76315、ab119352、ab226977、ab194583、ab81083、ab2302、ab59164、ab6717）均购自美国Abcam公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：SLDL-100）购自美国BioAssay Systems公司。培养箱（型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC）购自日本松下公司；荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500）购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪（型号：Stat Fax-2100）购自美国Awareness公司；流式细胞仪（型号：Guauasoft 6L）购自美国Millipor公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基培养HeLa细胞，并置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，细胞融合至80%左右时消化、传代，取对数生长期细胞进行实验。

分为对照组（细胞不进行转染）、mimic对照组、miR-148a mimic组、inhibitor对照组和miR-148a inhibitor组。除对照组外，其他组均使用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor和miR-148a inhibitor。转染步骤：细胞在转染前一天消化、计数铺24孔板，用含血清DMEM培养基培养，使之在转染日密度达90%，并替换为无血清培养基培养；分别取0.8～1.0 µg转染物miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor和miR-148a inhibitor并用50 µl DMEM培养基稀释；取2 µl转染试剂Lipofectamine 2000并用DMEM培养基稀释，5 min内与转染物稀释液混合，室温保温20 min后加入每孔中轻轻摇匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。

1.2.2 qRT-PCR法检测HeLa细胞中miR-148a和STAT3的表达 将转染后的各组HeLa细胞以1×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养48 h后收集细胞，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，qRT-PCR试剂盒检测细胞中miR-148a、STAT3 mRNA表达水平，U6、β-actin为内参基因。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火35 s，循环40次。miR-148a上游引物：5'-TCTGAGACACTCCGACTCTGA-3'，下游引物：5'-CTGGCGTCTGGAGCACTG-3'；STAT3上游引物：5'-ACTCCATCGCTGACAAAA-3'，下游引物：5'-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3'；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin上游引物：5′-TCCCATCACCATCTTCCAG -3′，下游引物：5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。结果分析采用2-ΔΔCt法表示。

1.2.3 MTT法检测HeLa细胞增殖 将未转染的HeLa细胞及转染后的各组HeLa细胞以1×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔100 μl，未转染的HeLa细胞用不同浓度的顺铂（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L）处理48 h，转染后的各组HeLa细胞用4 μmol/L顺铂处理48 h，每孔加50 μl 5 mg/ml的MTT溶液，置于培养箱继续培养4 h，弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，充分溶解后终止反应，根据酶标仪450 nm处测定的各孔吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡情况 将转染后的各组HeLa细胞以1×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔100 μl，4 μmol/L顺铂处理48 h后收集细胞，胰酶消化后再次收集，加入400 μl Binding Buffer将细胞重悬，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，混匀，避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 流式细胞仪检测HeLa细胞周期分布 将转染后的各组HeLa细胞以1×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔100 μl，4 μmol/L顺铂处理48 h后收集细胞，PBS洗涤，每孔加900 μl 75%乙醇固定过夜，离心收集细胞，PBS洗涤后每孔加500 μl RNase A/PI（50 μg/ml RNase A，50 μg/ml PI）重悬，避光放置20 min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.6 Western blot法检测HeLa细胞中STAT3通路相关蛋白表达 将转染后的各组HeLa细胞以1×105个/毫升接种于24孔培养板，每孔300 μl，4 μmol/L顺铂处理48 h后收集细胞，加裂解液置于冰上裂解30 min，1200 r/min离心10 min后加200 μl Loading Buffer，100℃煮沸10 min，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白质，半干法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1.5 h，加入一抗（p-STAT3抗体、STAT3抗体、Cyclin D1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Cleaved caspase-3抗体、GAPDH抗体，1:1000）孵育过夜，TBST洗涤3遍，加二抗（羊抗兔，辣根过氧化物酶标记，1:2000）孵育1 h，TBST洗膜3遍，曝光显影，BandScan图像分析系统扫描图像并分析条带灰度，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a与STAT3的靶向作用关系 利用miRTarBase网站预测miR-148a与STAT3的靶向关系及潜在结合位点。构建STAT3的野生型、突变型3'UTR-荧光素酶表达载体（STAT3-WT和STAT3-MUT），利用脂质体转染技术将其分别与miR-control、miR-148a mimic共同转入HeLa细胞中，48 h后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性，以萤火虫与海肾荧光素酶活性比值表示荧光素酶相对活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0版统计软件进行数据分析。所得数据以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后各组HeLa细胞中miR-148a和STAT3的表达

转染后，与对照组相比，mimic对照组、inhibitor对照组HeLa细胞中miR-148a、STAT3 表达水平差异无统计学意义（P=0.980、0.999，P=0.999、0.999）；与mimic对照组相比，miR-148a mimic组HeLa细胞中miR-148a表达水平显著升高（P=0.000），STAT3表达水平显著降低（P=0.000）；与inhibitor对照组相比，miR-148a inhibitor组HeLa细胞中miR-148a表达水平显著降低（P=0.000），STAT3表达水平显著升高（P=0.000），见图1。

图1 转染后各组HeLa细胞中miR-148a、STAT3的表达水平Figure 1 Expression level of miR-148a and STAT3 in HeLa cells after transfection

2.2 不同浓度的顺铂对HeLa细胞增殖的影响

随着顺铂浓度的升高，HeLa细胞增殖抑制率逐渐升高；HeLa细胞的顺铂IC20约为4 μmol/L，见图2。后续实验将以4 μmol/L为顺铂处理浓度。

图2 不同浓度顺铂作用下HeLa细胞增殖抑制率 (x±s,n=6)Figure 2 Proliferation inhibition rate of HeLa cells under different concentrations of cisplatin treatment (x±s,n=6)

2.3 miR-148a对HeLa细胞增殖的影响

与对照组相比，mimic对照组、inhibitor对照组HeLa细胞OD值差异无统计学意义（P=0.969、0.969）；与mimic对照组相比，miR-148a mimic组HeLa细胞OD值显著降低（P=0.000）；与inhibitor对照组相比，miR-148a inhibitor组HeLa细胞OD值显著升高（P=0.000），见图3。

图3 各组HeLa细胞OD值Figure 3 OD values of HeLa cells in each group

2.4 miR-148a对HeLa细胞凋亡的影响

与对照组相比，mimic对照组、inhibitor对照组HeLa细胞凋亡率差异无统计学意义（P=0.952、0.981）；与mimic对照组相比，miR-148a mimic组HeLa细胞凋亡率显著升高（P=0.000）；与inhibitor对照组相比，miR-148a inhibitor组HeLa细胞凋亡率显著降低（P=0.000），见图4。

图4 各组HeLa细胞凋亡情况Figure 4 Apoptosis of HeLa cells in each group

2.5 miR-148a对HeLa细胞周期分布的影响

与对照组相比，mimic对照组、inhibitor对照组HeLa细胞G0/G1、S、G2/M期比例差异无统计学意义（P=0.999、0.828,P=0.980、0.998,P=0.437、0.999）；与mimic对照组相比，miR-148a mimic组HeLa细胞G0/G1期比例显著升高（P=0.000），S、G2/M期细胞比例显著降低（P=0.000,P=0.000）；与inhibitor对照组相比，miR-148a inhibitor组HeLa细胞G0/G1期比例显著降低（P=0.000），S、G2/M期细胞比例显著升高（P=0.005,P=0.002），见图5。

图5 各组HeLa细胞周期分布情况Figure 5 Distribution of HeLa cells cycle in each group

2.6 miR-148a对HeLa细胞中STAT3通路相关蛋白的表达

与对照组相比，mimic对照组、inhibitor对照组HeLa细胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义（P=0.952、0.996,P=0.999、0.981，P=0.820、0.996,P=0.999、0.992,P=0.990、0.990）；与mimic对照组相比，miR-148a mimic组HeLa细胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P=0.000,P=0.000,P=0.000），Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高（P=0.000,P=0.000）；与inhibitor对照组相比，miR-148a inhibitor组HeLa细胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P=0.000,P=0.000,P=0.000），Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低（P=0.007,P=0.000），见图6。

图6 各组HeLa细胞中STAT3通路相关蛋白表达Figure 6 Expression level of STAT3 pathway-related protein in HeLa cells of each group

2.7 HeLa细胞中miR-148a与STAT3的靶向作用关系

miRTarBase网站预测发现STAT3可能为miR-148a的下游靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-148a对转染突变型STAT3 3'UTR-荧光素酶表达载体细胞的荧光素酶活性无明显影响（P=0.134），但可抑制转染野生型STAT3 3'UTR-荧光素酶表达载体细胞的荧光素酶活性（P=0.000），见图7～8。

图7 miRTarBase预测miR-148a与STAT3的靶向关系Figure 7 Targeting relation between miR-148a and STAT3 predicted by miRTarBase

图8 各组HeLa细胞相对荧光素酶活性Figure 8 Relative luciferase activity of HeLa cells in each group

3 讨论

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，发病率、死亡率较高，严重威胁女性健康及生命安全。目前，已有包括手术切除、化疗、放疗、激素治疗在内的多种治疗措施被引入并应用于宫颈癌，但肿瘤复发仍是导致宫颈癌患者死亡的主要原因[9]。辅助化疗是减少肿瘤复发的传统治疗策略，可明显提高肿瘤局控率及改善患者生存率[10]。顺铂是化疗的基础药物，但患者在治疗过程中出现各种不良反应，不利于患者的治疗效果及身心健康[11]。临床上常通过联合治疗，在保证癌细胞敏感度不降低的前提下，降低顺铂用药剂量及频次，减轻不良反应[12]。因此，寻找在顺铂低剂量下，提高宫颈癌细胞顺铂化疗敏感度的方法具有重要意义。本研究通过设置顺铂浓度梯度，发现4 μmol/L顺铂最接近HeLa细胞的IC20，故后续实验均以4 μmol/L为顺铂处理浓度。

miRNA是一种非编码小RNA分子，通过与靶基因mRNA的3’未翻译区序列特异性结合，在肿瘤细胞的增殖、凋亡及放化疗敏感度等生物学行为方面发挥重要的调控作用[13-14]。李航等[15]研究表明，人为过表达miR-148a能降低肺癌A549、H1299细胞的增殖能力，并增强其放射敏感度。陈元元等[6]研究中亦发现，miR-148a-3p与乳腺癌的紫杉醇耐药性有关，可用于判断患者的紫杉醇耐药情况。Li等[16]研究认为，miR-148a-3p下调是胃癌患者化疗过程中产生顺铂耐药性的关键步骤，miR-148a-3p可能是克服胃癌顺铂耐药性的预后标志物或治疗候选物。Kim等[5]研究发现，miR-148a能通过靶向Rab14诱导肾癌细胞凋亡，降低肾癌细胞克隆形成性并增加顺铂敏感度。本研究显示，在4 μmol/L顺铂处理过程中，过表达miR-148a后，HeLa细胞OD值及S、G2/M期细胞比例显著降低，凋亡率及G0/G1期细胞比例显著升高；抑制miR-148a表达后，HeLa细胞OD值及S、G2/M期细胞比例显著升高，凋亡率及G0/G1期细胞比例显著降低，提示在顺铂诱导基础上，miR-148a可进一步诱导HeLa细胞，将细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制HeLa细胞增殖并促进细胞凋亡，增强HeLa细胞的顺铂敏感度。

STAT3是转录信号转导子与激活子家族的重要成员，其持续激活会导致癌细胞中抗凋亡蛋白及细胞周期调控因子上调，促进肿瘤异常增殖及恶性转化[17]。Bcl-2和Bax为Bcl-2家族的重要成员，对细胞凋亡分别具有抑制和促进作用[18]。Caspase-3是各种细胞凋亡途径的共同执行蛋白，Cleaved caspase-3是其活性形式[19]。Cyclin D1是重要的细胞周期调控因子，在细胞从G0期进入G1期过程中发挥重要调控作用[20]。双荧光素酶报告基因实验显示，在HeLa细胞中，STAT3为miR-148a的下游靶基因。进一步通过蛋白检测显示，在4 μmol/L顺铂处理过程中，过表达miR-148a后，HeLa细胞中STAT3 mRNA及蛋白磷酸化水平、Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平显著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平显著升高；反之，抑制miR-148a表达后，HeLa细胞中STAT3 mRNA及蛋白磷酸化水平、Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平显著升高，Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平显著降低，提示在顺铂诱导基础上，miR-148a可能通过靶向抑制STAT3的表达与活化，影响Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平，进而调控HeLa细胞的增殖、凋亡、细胞周期进程，增强HeLa细胞的顺铂敏感度。

综上所述，miR-148a可靶向抑制STAT3，在顺铂处理宫颈癌HeLa细胞基础上，抑制HeLa细胞增殖、诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡，对HeLa细胞顺铂化疗敏感度具有增强作用，在临床化疗中顺铂小剂量用药方向具有一定前景。