HPLC测定利奈唑胺原料药中3个降解杂质

彭相君，于丽萍，路 易

（1. 日照市第二人民医院，山东 日照 276807；2. 山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400）

利奈唑胺（linezolid）为全合成的噁唑烷酮类抗菌药，其结构式见图1。利奈唑胺对革兰阳性球菌特别是多重耐药的革兰阳性球菌有良好的抗菌活性，对葡萄球菌、链球菌敏感[1-3]。由于利奈唑胺具有独特的作用位点和方式，不易与其他抗菌药产生交叉耐药性，在临床上用于革兰阳性菌引起的肺炎、皮肤软组织感染、脑膜炎、心内膜炎、菌血症、骨髓炎和外科手术感染等的治疗[4-5]。

利奈唑胺分子结构中存在酯键和酰胺键，在贮存过程中可能产生降解，有文献报道[6-10]，利奈唑胺在碱性环境下主要降解产物为杂质I与杂质II；酸性环境下主要降解产物为杂质III。其降解过程见图1。本研究建立梯度洗脱方法，同时测定利奈唑胺中杂质I、杂质II和杂质III，采用对照品外标法计算3种杂质的含量，定量准确，为利奈唑胺的杂质控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（含四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，美国Agilent公司）；Mettler Toledo 205电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

利奈唑胺对照品（纯度：99.7 %，批号：DZ170201），杂质I对照品（纯度：99.5 %，批号：DZ170207），杂质II对照品（纯度：99.8 %，批号：DZ170208），杂质III对照品（纯度：99.5 %，批号：DZ170209），利奈唑胺原料药（批号：190301，190302，190303，临沂莱博科技公司）；乙腈为色谱纯，三氟乙酸为优级纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为0.1 %三氟乙酸乙腈溶液，B相为0.1 %三氟乙酸水溶液，线性梯度洗脱，程序见表1；流速1.0 ml/min；检测波长 254 nm；柱温30 ℃；进样量 10 μl。

表1 线性梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品贮备液 分别精密称取利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III对照品各约100 mg，置100 ml量瓶中，用溶剂（流动相A:流动相B=10:90）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000 μg/ml的对照品贮备液。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密量取上述对照品贮备液各1.0 ml，置同一100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得浓度为10 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.3 系统适用性试验溶液 精密量取对照品贮备液各适量，用溶剂定量稀释制成含利奈唑胺约1000 μg/ml，含杂质I、杂质II和杂质III均约1 μg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液。

2.2.4 供试品溶液 精密称取利奈唑胺原料药约100 mg，置100 ml量瓶中，用溶剂溶解并定容，即得浓度为1000 μg/ml的供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

取2.2项下溶剂、系统适用性试验溶液和供试品溶液，分别进样，记录色谱图，见图2。色谱图中各色谱峰均分度良好，各色谱峰的理论板数均在5000以上。

图2 专属性色谱图

2.4 专属性试验

取利奈唑胺原料药，分别进行下列试验：（1）酸降解试验：取利奈唑胺原料药约25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的盐酸溶液5 ml，室温放置5 h，精密加入1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml中和，加入溶剂稀释至刻度，摇匀；（2）碱降解试验：取利奈唑胺原料药约25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入1 mol/L的氢氧化钠溶液5 ml，80 ℃水浴加热10 min，放冷，精密加入1 mol/L盐酸溶液5 ml中和，加入溶剂稀释至刻度，摇匀；（3）氧化降解试验：取利奈唑胺原料药约25 mg，置25 ml量瓶中，精密加入3 %过氧化氢3 ml，摇匀，室温放置5 h，强烈振摇至无气泡产生，再加入溶剂稀释至刻度，摇匀；（4）高温降解试验：取利奈唑胺原料药适量，置称量瓶中，置烘箱中，于130 ℃加热3 h，取出，放冷，精密称取25 mg，置25 ml量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；（5）光照降解试验：取利奈唑胺原料药约25 mg，置25 ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，倒入石英吸收皿中，置澄明度检测仪下，调节光照强度为4000 lx，放置24 h。取以上降解试验溶液，按2.1项色谱条件进样测定，记录色谱图，见图3。结果显示，利奈唑胺在酸、碱、氧化条件下有关物质的含量均增加，在高温和光照条件下较稳定。其中酸性与碱性条件影响较显著，在酸性条件下水解，主要产生杂质III；在碱性条件下，主要生成杂质I和杂质II。各降解物色谱峰与主峰间均能良好分离。

图3 降解试验色谱图

2.5 线性关系试验

精密量取利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III对照品贮备溶液适量，用溶剂分别稀释制得浓度为0.1，0.5，1，5，10 μg/ml的系列溶液，分别进样，记录色谱图。以对照品溶液浓度c（μg/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III的标准曲线方程和相关系数（r）结果见表2。结果表明，利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III的线性关系良好。

2.6 定量限与检测限

取利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III对照品贮备溶液，用溶剂逐步稀释，按2.1项下色谱条件测定，以S/N=10求得利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III的定量限（LOQ），以S/N=3求得利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III的检测限（LOD），结果见表2。

表2 利奈唑胺及各杂质的线性试验、LOD和LOQ结果

2.7 精密度试验

取2.5项下对照品溶液（浓度为1 μg/ml），重复进样6次，计算利奈唑胺、杂质I、杂质II和杂质III各色谱峰峰面积的RSD分别为0.47 %，0.23 %，0.38 %和0.32 %。表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密称取利奈唑胺原料药100 mg，按2.2.4项下方法配制供试品溶液，于室温下放置0，4，8，12，16，24 h后进样，记录色谱图，结果杂质I、杂质II和杂质III峰面积的RSD分别为1.36 %，1.49 %和1.65 %。表明样品溶液在室温下放置24 h内稳定。

2.9 重复性试验

精密称取利奈唑胺原料药100 mg，共6份，按2.2.4项下方法配制供试品溶液，分别进样测定，记录色谱图，计算杂质I、杂质II和杂质III的含量，结果杂质I、杂质II和杂质III含量的RSD分别为1.75 %，1.51 %和1.58 %。表明该方法重复性良好。

2.10 回收率试验

精密称取已测得各杂质含量的利奈唑胺原料药（批号：190301）约50 mg，共9份，各置100 ml量瓶中，分别加入杂质I、杂质II和杂质III对照品贮备溶液适量，配制成约相当于各杂质浓度水平50 %，100 %和150 %的溶液，各3份，作为加样回收率试验溶液，分别进样，计算杂质I、杂质II和杂质III的加样回收率，结果见表3。杂质I、杂质II和杂质III的平均回收率分别为97.36 %，96.76 %和95.54 %，RSD分别为1.62 %，1.22 %和1.82 %。

表3 回收率试验结果（n=9）

2.11 样品测定

取利奈唑胺原料药3批，按2.2.4项下方法分别配制供试品溶液，进样测定，记录色谱图，采用对照品外标法分别计算杂质I、杂质II和杂质III的含量，结果见表4。

表4 杂质I、杂质II和杂质III测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本文采用梯度洗脱，在流动相中加入0.1 %三氟乙酸，各色谱峰分离良好，峰形尖锐且对称，柱效较高。采用二极管阵列检测器，各物质在254 nm波长处均有较强的紫外吸收，因此选择254 nm作为检测波长。

3.2 溶剂的选择

对照品溶液与供试品溶液的配制溶剂均采用初始梯度时流动相的比例，即流动相A:流动相B=10:90。用初始梯度流动相溶解样品，可避免各色谱峰前延或托尾的现象，使峰形正态，积分准确。

3.3 方法耐用性考察

参照《中国药典》2020年版中对方法耐用性的要求[11]，对2.1项下色谱条件进行微小调整，通过改变柱温（25 ℃、35 ℃及室温）、流速（0.8 ml/min及1.2 ml/min）、检测波长（252 nm，256 nm）与色谱柱品牌型号等试验条件，考察该方法的耐用性。结果显示以上色谱条件变化对分离效果影响不大。

利奈唑胺在存放过程中可能产生降解产物，通过查阅文献及对利奈唑胺原料药在酸、碱、氧化、高温和强光照射条件下的破坏试验，杂质I、杂质II和杂质III是利奈唑胺的主要降解杂质。本文建立HPLC方法，对利奈唑胺中3种主要降解杂质进行测定，为利奈唑胺质量控制提供参考。