彝心康胶囊质量标准提升研究

覃媛媛，杨宗荣，罗艳珠，温吉星

（1. 云南省楚雄彝族自治州食品药品检验所，云南 楚雄 675000； 2. 云南龙发制药股份有限公司，云南 楚雄 675000）

彝心康胶囊由鸡血藤、灯盏细辛、五气朝阳草、透骨草等7 味中药材经提取制成的彝药制剂，功效为理气活血、通经止痛（彝医称为乌诺衣诺、四乃土），临床用于治疗气滞血瘀所致胸痹心痛、心悸怔忡，以及冠心病、缺血性脑血管病见上述症状者。其现行标准为国家药品监督管理局标准[WS－10277（ZD－0277）－2002]，鉴别项下仅有姜黄及木香的薄层鉴别，含量项下仅有虎杖中大黄素的含量测定。本研究中新增薄层色谱（TLC）法对鸡血藤和灯盏细辛进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定虎杖中虎杖苷和灯盏细辛中野黄芩苷含量，旨在提升其质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1100 型高效液相色谱仪，含VWD 检测器（美国Agilent 公司）；BP211D 型电子分析天平（德国赛多利斯电子公司，精度为0.01 mg）；MS304 TS／02 型电子分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司，精度为0.1 mg）；GoodLook－1000 型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；ELGA 超纯水机（法国威立雅公司）；SB25－12DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；薄层预制G 板（青岛海洋化工厂分厂、烟台市化学工业研究所、德国Merck 公司）。

1.2 试药

芒柄花素对照品（批号111703－201504，供鉴别用），虎杖苷对照品（批号为111575－201603，含量为87.3%），野黄芩苷对照品（批号为110758－201616，含量为91.7% ），鸡血藤对照药材（批号为121173－201805），灯盏细辛对照药材（批号为121269－201103），均购自中国食品药品检定研究院；彝心康胶囊（批号分别为180501，180502，180503，180504，180901，180902，180903，180904，181001，181002），阴性样品，均购自云南龙发制药股份有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

鸡血藤：取样品内容物1.5 g，精密称定，加乙醇40 mL，超声(功率200 W，频率40 kHz，下同)处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯10 mL 振摇提取，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇5 mL 使溶解，经中性氧化铝柱（中性氧化铝200 ～300 目，5 g，内径为1.5 cm，干法装柱），用80%甲醇60 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取鸡血藤对照药材1 g，加水50 mL，煎煮30 min，滤过，滤液加乙酸乙酯振摇提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为对照药材溶液。取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的对照品溶液。取缺鸡血藤的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照TLC法试验，精密吸取供试品溶液、阴性对照品溶液和对照药材溶液各4 μL，对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇（20 ∶1，V／ V）为展开剂，预饱和15 ～30 min，展开，取出，晾干，置氨气中熏后，在紫外光（254 nm）灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图1 A。

图1 薄层色谱图Fig.1 TLC chromatograms

灯盏细辛：取样品内容物1.5 g，精密称定，加0.2%碳酸氢钠溶液15 mL，浸泡过夜，滤过，滤液用稀硫酸调pH 至3.0，加无水甲醇20 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL 使溶解，用正丁醇振摇提取2 次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取灯盏细辛对照药材1 g，同其供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。取野黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的对照品溶液。取缺灯盏细辛的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液，照TLC 法试验，吸取上述4 种溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图1 B。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）；流速：1.0 mL／min；检测波长：335 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取虎杖苷和野黄芩苷对照品各适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL 含野黄芩苷40.348 μg 和虎杖苷111.744 μg 的混合对照品溶液。取样品内容物0.3 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。分别取不含虎杖药材和不含灯盏细辛药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性和系统适用性试验：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺虎杖的阴性对照品溶液、缺灯盏细辛的阴性对照品溶液各10 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相同色谱峰，且主峰与相邻色谱峰能完全分离，峰形良好，阴性对照无干扰；理论板数以虎杖苷峰和野黄芩苷峰计应不低于5 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图2。

图2 高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液1，2，3，5，10，15 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（Y）、进样量为横坐标（X）进行线性回归，得虎 杖 苷 回 归 方 程 Y1＝2 017.363 X1＋182.490（R2＝0.999 2，n ＝6），野黄芩苷回归方程Y2＝2 844.953 X2＋44.924（R2＝0.999 5，n ＝6）。结果表明，虎杖苷和野黄芩苷进样量分别在0.112 ～1.676 μg 和0.040 ～0.605 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.2.1 项下色谱条件重复进样6 次。结果虎杖苷和野黄芩苷平均峰面积分别为2 675.672 和1 274.369，RSD 分别为0.68%和0.38%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取混合对照品溶液和供试品（批号为180501）溶液，室温下按2.2.1 项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时进样测定，记录色谱图。结果混合对照品溶液和供试品溶液中虎杖苷和野黄芩苷峰面积的RSD 分别为0.40%和0.32%，1.33%和1.19%（n ＝8），表明2 种溶液室温下24 h 内均稳定。

重复性试验：取同一批（批号为180501）样品内容物6 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，以2.2.1项下色谱条件进样测定。结果虎杖苷和野黄芩苷平均含量分别为8.351 5 mg／g 和2.657 6 mg／g，RSD 分别为0.63%和0.35%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（批号180501）内容物6 份，每份0.15 g，精密加入相当于样品中所含虎杖苷和野黄芩苷量100%的对照品贮备液，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 样品含量测定

取10 批样品，依法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 10 批样品中虎杖苷和野黄芩苷含量测定结果（mg／粒，n ＝2）Tab.2 Content determination of polydatin and scutellarin in 10 batches of samples（mg／capsule，n ＝2）

3 讨论

3.1 TLC 条件筛选

鸡血藤：鸡血藤TLC 为新增项，在进行方法摸索时，首先参照2015 年版《中国药典(一部)》[1]（注：作者试验时2020 年版《中国药典》尚未正式执行，且2020 年版《中国药典》此项无改动，下同）中“鸡血藤”鉴别项下方法，因样品为复方制剂，其余处方药材对鸡血藤的干扰较大，TLC 结果欠佳，后参照2015 年版《中国药典(一部)》“花红片”项下鉴别（3）、“花红胶囊”项下鉴别（3）、“止痛化片”项下鉴别（6）及文献[2－3]的展开系统确定了鸡血藤的TLC 方法。以上资料中均仅使用对照药材作为对照，通过文献[4]确定芒柄花素为鸡血藤中特征性成分，因此加入芒柄花素对照品协同鸡血藤对照药材作为双对照。

灯盏细辛：灯盏细辛TLC 为新增项，由文献[5]可知，灯盏细辛中含有野黄芩苷、咖啡酸等化学成分，通过文献[6]确定了灯盏细辛的TLC 方法。在预试验中同时也增加了咖啡酸对照品，但相同的TLC 条件下咖啡酸对照品斑点不明显，因此最终未选择咖啡酸作为对照。

3.2 TLC 耐用性考察

分别采用前述不同来源的薄层板，分别在无饱和、预饱和30 min、预饱和60 min，低温（5 ～15 ℃）、常温（20 ～30 ℃）、高温（40 ～50 ℃），低湿度（相对湿度30% ～40%）、高湿度（相对湿度65% ～75%）条件下考察，均能获得良好的色谱分离效果，斑点清晰、圆整，且阴性对照无干扰。鸡血藤TLC 在不饱和的情况下会发生边缘效应，故规定预饱和时间为15 ～30 min，进而形成文中有效的鉴别方法。

3.3 HPLC 检测波长选择

通过文献[5，7]可知，虎杖和灯盏细辛中分别含有虎杖苷、野黄芩苷2 种有效成分。分别取虎杖苷对照品和野黄芩苷对照品，用甲醇溶解后，以甲醇作空白对照，在紫外可见区进行全波段扫描，虎杖苷和野黄芩苷分别在318 nm 和335 nm 波长处有最大吸收，结合紫外响应值大小、色谱峰峰形尖锐、阴性无干扰等条件，选择335 nm作为检测波长。

3.4 HPLC 方法选择

流动相：在摸索虎杖和灯盏细辛的含量测定方法时，参考2015 年版《中国药典(一部)》[1]中“虎杖”“护肝宁片”“灯盏细辛”“灯盏生脉胶囊”“灯盏花素片”含量测定项下色谱条件及文献[8－9]，分别考察了乙腈－水（15 ∶85 和23 ∶17，V／ V），乙腈－0.2%磷酸溶液（15 ∶85 和14 ∶86，V／ V），甲醇－0.2%磷酸溶液（35 ∶65 和30 ∶70，V／ V），乙腈－四氢呋喃－0.2%磷酸溶液（14 ∶14 ∶72，V／ V／ V）等不同配比作为流动相进行试验，结果表明，乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）为最佳流动相，能使被测成分与其他成分较好地分离，峰形好，阴性对照无干扰。

提取溶剂和提取方法：考察了水、稀乙醇、50%甲醇、甲醇4 种溶剂的提取效果，采用50%甲醇提取时得率最高，测定无干扰，测定峰与相邻杂质峰分离度均在1.5 以上，故采用50%甲醇作为提取溶剂。同时考察了超声处理（250 W，50 kHz）、60 ℃振摇、加热回流3 种提取方法的效果，结果显示，超声提取和加热回流提取对2 种有效成分的影响相似，但超声提取操作简单易行，故采用超声提取；以50%甲醇为溶剂时，考察了超声处理（250 W，50 kHz）15，30，45，60 min 对2 种有效成分提取效果的影响，发现超声30 min 时2 种有效成分基本提取完全，故被选用。

耐用性：同时对不同厂家、型号色谱柱（Agilent Eclipse XDB－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent 5 HC－C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo AcclaimTM120－C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），不同柱温（25，30，35，40 ℃），不同流速（0.8，1.0，1.2 mL／min）条件进行了考察，结果上述色谱条件的色谱峰峰形、分离度、理论板数发生一定程度变化时，均能满足试验要求，耐用性较好。

3.5 方法评价

本研究中建立的TLC 法专属性强、灵敏度高，HPLC 法简便可行，结果准确、可靠，重复性、稳定性好，可用于彝心康胶囊的质量控制。