人类白细胞抗原基因多态性与服用氯氮平患者白细胞计数相关性研究*

王姝姗，曲，朱浩浩，张忠东

（南京医科大学附属无锡精神卫生中心药学部，江苏 无锡 214151）

氯氮平为非典型抗精神分裂症药物，能显著改善病程和预后，并对难治性精神分裂症有效[1]。因其使用过程中会引起白细胞减少症（LP）和严重的粒细胞缺乏症（发生率约为1%），并不作为首选药物[2－3]。以往通过监测血药浓度协助临床调整药物剂量[4－5]，近年来关于基因多态性和血药浓度潜在的相互关联与LP 的差异分析成为研究热点。有研究表明，人类白细胞抗原基因( HLA－ B)差异是氯氮平导致LP 个体差异的重要原因之一[6]，可从此着手减少不良反应的发生风险。本研究中探讨了HLA－ B*57 ∶01[分为野生(G／G)型和杂合(G／A)型]、HLA－B*35∶08[分为野生(G／G)型、杂合(G ／A)型、突变(A ／A)型]基因多态性与精神分裂症患者氯氮平用药治疗过程中血药浓度和LP 的相关性，为减少不良反应发生风险及安全用药提供参考。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取医院2018 年至2019 年收治的精神分裂症患者，年龄18 ～65 岁；汉族；符合第10 版国际疾病分类标准（ICD－10）关于精神分裂症的诊断（F20）；以氯氮平为主要治疗药物，白细胞计数（WBC）为(4 ～10) ×109L－1。排除严重躯体疾病、妊娠妇女，以及氯氮平治疗前已存在外周血白细胞绝对计数和／或粒细胞绝对值异常者。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 方法

用药情况统计：统计患者使用氯氮平治疗精神分裂症的实际剂量，首次剂量为25 ～75 mg／d，逐渐缓慢增加至常用剂量200 ～400 mg／d，最高可达600 mg／d。根据患者的临床表现可调整为25 ～600 mg／d，调整间隔不短于24 h。

血药浓度监测：患者使用氯氮平需5 ～7 个消除半衰期后达到稳态血药浓度。约9 ～10 d（±1 d）后，末次服药15 ～45 min 前，采集外周静脉血4 mL，置乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，离心，分离得血浆，－20 ℃保存。采用FLC－2701 型全自动二维液相色谱耦合仪（长沙安莱科分析仪器有限公司），第一维色谱系统（LC1）主要负责样品在线富集及第一维初步分离，第二维色谱系统（LC2）主要负责进一步分离检测。第一维色谱柱为Aston SX1 柱（25 mm × 4.6 mm，5 μm），流 动 相 为10 mmol／L 磷酸二氢铵－乙腈－甲醇（92 ∶6 ∶2，V／ V／ V，pH 3.5），流速为1.0 mL／min，中间柱为Aston SCB 柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；第二维色谱柱为Aston SCB柱（100 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为20 mmol／L 磷酸二氢铵－乙腈－甲醇（50 ∶30 ∶20，V／ V／ V，pH 3.0），流速为1.2 mL／min，进样量为200 μL，柱温为40 ℃。紫外吸收波长channel 1 为262 nm，channel 2 为290 nm。氯氮平血药浓度测定，考察线性范围，结果线性范围为0 ～1 105.2 ng／mL( R2＝0.999 9)。计算单位剂量血药浓度（血药浓度－剂量比）。

HLA 基因检测：采用多重SNaPShot 检测方法检测HLA－ B 基因位点，测序分型首先需通过多重聚合酶链反应（PCR）扩增得到包含所研究SNP 位点的DNA 片段，采用3730XL 型基因测序仪（美国ABI 公司）检测HLA－B*57∶01、HLA－B*35∶08基因多态性，上游引物分别为5′－TGTTCAGTGGCTCCGAGCACA－3′和5′－CTCTTAGCAATTGTACCCATC－3′，下游引物分别为5′－GGCCAGAGAGGCTGCCACATG－3′和5－TAGTAAGCAGTAGGGAGTAAC－3′。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料

共入组150 例患者，其中男65 例，女85 例；平均年龄（46.07±10.22）岁；稳态时氯氮平稳态血药浓度为（415.39±10.95）ng／mL，其中女性较男性高，与杨淑珍等[7]的研究结果一致。详见表1。

表1 患者一般资料（± s）Tab.1 General data of patients（± s）

表1 患者一般资料（± s）Tab.1 General data of patients（± s）

注：与女性比较，*P ＜0.05。Note：Compared with those of female，*P ＜0.05.

项目年龄(岁)发病年龄(岁)氯氮平稳态血药浓度（ng／mL）男性（n ＝65）45.91±12.75 28.40±11.60 311.04±6.38*女性（n ＝85）46.44±11.38 30.31±12.07 454.21±12.64合计（n ＝150）46.07±10.22 29.32±10.30 415.39±10.95

2.2 服药剂量对血药浓度的影响

结果见表2。可见，服用不同日剂量氯氮平的患者血药浓度－剂量比无显著差异（P ＞0.05）。

表2 不同日剂量氯氮平患者的血药浓度Tab.2 Plasma concentration of patients treated with different daily doses of clozapine

2.3 基因型对氯氮平血药浓度及WBC 的影响

HLA－B*57∶01基因中，G／G 型与G／A 型患者氯氮平血药浓度和WBC 均无显著差异（P ＞0.05）。HLA－B*35∶08基因中，3 型患者氯氮平血药浓度无显著差异（P ＞0.05），但A／A 型患者的WBC 显著低于G／G 型和G／A 型（P ＜0.05）。详见表3。

表3 不同基因型患者的氯氮平血药浓度和白细胞计数（± s）Tab.3 Plasma concentration of clozapine and WBC of patients with different genotypes（± s）

表3 不同基因型患者的氯氮平血药浓度和白细胞计数（± s）Tab.3 Plasma concentration of clozapine and WBC of patients with different genotypes（± s）

基因型HLA－B*57 ∶01 G／G 型（n ＝96）G／A 型（n ＝54）P 值HLA－B*35 ∶08 G／G 型（n ＝74）G／A 型（n ＝53）A／A 型（n ＝23）P 值血药浓度（ng／mL）318.67±11.93 347.17±4.64 0.563 329.46±13.66 377.74±4.98 364.28±1.90 0.052白细胞计数（×109 L－1）4.65 ±0.34 4.53 ±0.52 0.674 4.27 ±0.63 4.55 ±0.72 3.77 ±0.24 0.043

3 讨论

药物致白细胞减少主要有2 种机制，一种是药物选择性对骨髓造血系统的白细胞有直接的、呈量效关系的毒性作用，可抑制粒细胞形成；另一种是迟发性反应，这可能是抗体介导的特异性、与剂量无关的、免疫源性的特异质反应[8－9]。本研究中，HLA－B*57∶01和HLAB*35∶08不同基因型间氯氮平血药浓度无显著差异，但HLA－B*35∶08（P ＜0.05）A／A 型患者的WBC 显著小于G／A 型和G／G 型，显示出免疫介导的特异性。WICISKI 等[10]的研究表明，尚未代谢的氯氮平被白细胞吸收，并通过氧化过程转化为诱导凋亡的代谢物。目前的理论认为，活性氧－硝酸根离子是引起LP 的最重要因素，有自身免疫的背景，而不是毒性[10]。

HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08不同基因型间氯氮平血药浓度无显著差异，提示氯氮平血药浓度在治疗范围内，但LP 患者可能存在白细胞中氯氮平血药浓度升高。

BERGEMANN 等[11]研究发现，LP 患者（1 例）白细胞中的氯氮平浓度约为接受氯氮平治疗患者（10 例，无严重不良反应）的8 倍，而氯氮平的血药浓度无显著差异。但该研究缺少对于HLA 的分析。本研究中并未检测白细胞内氯氮平浓度的差异，更未将这种差异与2 种基因进行关联分析，是本研究存在不足之处，需扩大样本量和改进分析设备。

HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08多态性主要与抗原结合裂缝有关，从而使HLA 同种异型所选择的自源性和病原体源性多肽抗原的种类多样化。部分研究强调了HLA 多态性在药物基因组学中的重要性，并为涉及小分子药物的HLA 连锁超敏反应提供机制分析[12－13]。在中国人群中，HLA－ A、－ B、－ C、－ DRB1 和－ DQB1 位点共有676 个等位基因被成功定义，包括159 个常见等位基因和517 个有文献记载的等位基因[14]。由于其多基因特性的复杂化，难具有普遍性，以至于开发具有高特异性和高灵敏度的临床预测性的基因产品困难重重[15]。

综上所述，HLA－B*57∶01和HLA－B*35∶08不同基因型引起WBC 不同程度减少，提示了LP 的HLA基因的免疫源性原因，为降低用药风险，提高用药的安全性提供了参考。但HLA 过于复杂的多基因特性，可能会阻碍开发具有临床实际应用价值的基因检测产品。