注射用血栓通对人CYP450 酶的体外抑制作用及对阿托伐他汀体外代谢的影响*

龚婧如，杨 涛，马芬芬，陆惠平

（上海市浦东医院药剂科，上海 201399）

中药注射剂是以中医药理论为指导，利用现代技术从中药材中提取有效成分而供静脉注射的制剂，它突破了中药传统给药方式，具有生物利用度高、作用迅速等特点[1]。然而，中药注射剂的药品不良（ADR）反应一直是社会关注焦点[2]。而ADR 发生的重要风险因素之一就是联合用药[3]。药物相互作用最常见的原因是细胞色素P450（CYP450）酶的抑制和诱导所产生的代谢性相互作用，引发ADR 或降低疗效[4]。注射用血栓通（冻干）是主要成分为三七总皂苷的中药注射剂，具有活血祛瘀、通脉活络功效，临床广泛用于心脑血管疾病的治疗[5－7]。目前，以三七总皂苷为主要成分的血栓通制剂对相关CYP450 酶的影响作用尚不十分明确，相关研究的结论并不一致[8－9]。阿托伐他汀是他汀类药物中应用最广泛的药物，主要由肝脏中的CYP3A4 酶代谢，具有调节血脂、抗炎、改善内皮功能及稳定斑块等作用，多用于心血管疾病的预防和治疗[10－11]。临床常以注射用血栓通（冻干）及其他以三七总皂苷为主要成分的同类药品联合阿托伐他汀钙治疗心脑血管疾病[12－15]，故有必要探讨它们之间基于CYP450 酶相互作用的可能性。本研究中拟通过在体外人肝微粒体孵育体系，考察注射用血栓通对CYP450 常见亚酶的抑制作用及对阿托伐他汀体外代谢的影响，揭示可能的药物相互作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与肝微粒体

仪器：液相色谱串联质谱系统，包括Shimadzu LC20型液相色谱（日本Shimadzu 公司），API4000 型自动进样器及API5000 型三重四极杆检测器（美国AB 公司）。

试药：注射用血栓通（冻干）（广西梧州制药＜集团＞股份有限公司，批号为19010107）；右美沙芬（瑞士Adamas－Beta 公司，批号为P1057725）；S－美芬妥英（上海相辉医药科技有限公司，批号为SW－LN001－112）；睾酮（德国Dr.Ehrenstoefer 公司，批号为50213）；磺胺苯吡唑（美国J＆K 公司，批号为LFCOQ02）；奎尼丁（加拿大TRC 公司，批号为5－JTN－32－1）；酮康唑（批号为ZJVZI－PM），对乙酰氨基酚（批号为5IXZKTD），均购自日本TCI 公司；4－羟基美芬妥英（香港Sohon.Chemtech 公司，批号为NA）；6β－羟基睾酮（上海ZZBIO，.CO，LTD 公司，批号为ZZS－19－012－C1）；阿托伐他汀钙（批号为LRAC0148），6－羟基氯唑沙宗（批号为1385519），特非那定（批号为MKBX6318V），丁螺环酮（批号为BCBR8275V），甲苯磺丁脲（批号为SLBV1577），右啡烷（批号为1385499V），4－甲基吡唑（批号为SLBQ1084V），α－萘黄酮（批号为SLCD1488），4－羟基双氯芬酸（批号为BCBS5961V），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，批号为110M5162V），非那西汀（批号为WXBC8937V），双氯芬酸钠（批号为BCBS5961V），氯唑沙宗（批号为MKBV6395V），噻氯匹定（批号为BCBK5476V），NADPH（批号为110M5162V）均购自美国Sigma 公司；其余试剂均为分析纯。

肝微粒体：人肝微粒体购自Bioreclamation IVT 公司，批号为VIN。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱串联质谱方法的建立

色谱条件：1)注射用血栓通体外酶抑制作用，色谱柱为Dikma Inspire C18柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脱，流速为450 μL ／ min，运行时 间2 min 或2.5 min（依分析成分）；柱温为40 ℃；进样量为4 μL 或5 μL（依分析成分）。2)注射用血栓通与阿托伐他汀体外相互作用，色谱柱为Phenomenex Synegi Hydro RP 柱（30 mm×2 mm，4 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1% 甲 酸 乙 腈 溶 液（B），梯 度 洗 脱；流 速 为450 μL ／ min；柱温为45 ℃；进样量为2 μL，运行时间为1.8 min（阿托伐他汀）；进样量为5 μL，运行时间为2.5 min（6β－羟基睾酮）。

质谱条件：API4000 及API5000 三重四极杆检测器，采用电喷雾离子源正离子扫描模式（ESI＋），多反应监测扫描模式（MRM），离子电压为5 000 V，碰撞气气压为6 psi，气帘气气压为20 psi，雾化气气压为50 psi，辅助气气压为50 psi，温度为500 ℃。

方法学考察：按相关标准进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性试验的RSD 均小于10%，表明仪器精密度良好，样品溶液在室温放置24 h 内基本稳定，方法重复性良好。

1.2.2 溶液制备与样品处理

取注射用血栓通150 mg，精密称定，溶于2 mL 0.9% 氯化钠溶液中，质量分数计为100% 。然后用0.9% 氯化钠溶液依次稀释为质量分数为0.01% ，0.10%，0.50%，1.0%，10%，20%的系列工作溶液。

1.2.3 肝微粒体体外孵育体系的建立[16－17]

注射用血栓通体外酶抑制作用：CYP450 各亚酶（1A2，2C9，2C19，2D6，2E1，3A4）的底物非那西汀、双氯芬酸钠、S－美芬妥英、右美沙芬、6 羟基氯唑沙宗和睾酮的终浓度分别为30，25，50，8，100，100 μmol／L，对应的抑制剂α－萘黄酮、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁、4－甲基吡唑和酮康唑的浓度分别为30，10，5，10，60，5 μmol／L，混合人肝微粒体的终质量浓度为0.5 mg／mL，37 ℃电热恒温水浴孵育。试验设试验组、空白组和阳性对照组，均设3 个平行样本。肝微粒体分别与系列工作溶液、空白缓冲液（与测试物含等量有机溶液的PBS）和选择性抑制剂孵育15 min 后，分别加入各亚酶的探针底物和辅酶NADPH 孵育30 min。于体外孵育体系中加入预冷的甲醇终止反应，蛋白沉淀后，12 000 r／min 离心5 min，取上清液（下同），检测样品。CYP450 亚酶的相对活性以相对空白阴性对照的百分比表示，相对活性＝试验组或阳性对照组中的代谢产物生成量／空白阴性对照组中的代谢产物生成量×100%。采用GraphPad Prism 5 Project 软件计算半数抑制浓度（IC50）。

注射用血栓通与阿托伐他汀体外相互作用：CYP3A4 的底物睾酮与阿托伐他汀的终浓度分别为100 μmol／L 和0.5 μmol／L，抑制剂酮康唑的终浓度为5 μmol／L，混合人肝微粒体的终质量浓度为0.5 mg／mL，37 ℃电热恒温水浴孵育，试验设置试验组、阴性对照组和阳性对照组，均设3 个平行样本。试验组孵育体系中分别加入系列工作溶液预孵育15 min 后，分别加入阿托伐他汀（浓度0.5 μmol／L）和辅酶NADPH 孵育30 min。阴性对照1 组孵育体系中加入空白缓冲液和阿托伐他汀（0.5 μmol／L）后立即加入含内标甲醇终止。阴性对照2 组孵育体系中加入空白缓冲液预孵育15 min后，加入阿托伐他汀（0.5 μmol／L）和辅酶NADPH 孵育30 min。阳性对照组孵育体系中加入CYP3A4 的选择性抑制剂酮康唑（5 μmol／L）预孵育15 min 后，加入阿托伐他汀（0.5 μmol／L）和辅酶NADPH 孵育30 min。同法处理样品检测。以CYP3A4 亚酶底物阿托伐他汀的减少量或探针底物睾酮的代谢产物生成量评估测试物对CYP3A4 亚酶的抑制作用。计算试验组中阿托伐他汀的代谢量，代谢量＝阴性对照组中母体剩余量－试验组中母体剩余量。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 注射用血栓通体外酶抑制作用

结果见表1 和图1。可见，注射用血栓通对人肝微粒体中的CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4 的酶活性抑制存在浓度依赖性，其中对CYP3A4 的IC50为10.7%。

图1 注射用血栓通对CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4 的抑制曲线Fig.2 Inhibition curve of Xueshuantong for Injection on CYP2C19，CYP2D6 and CYP3A4

表1 注射用血栓通对6 种CYP450 亚酶的抑制作用（± s）Tab.1 Inhibitory effect of Xueshuantong for Injection on six kinds of CYP450 subenzymes（± s）

表1 注射用血栓通对6 种CYP450 亚酶的抑制作用（± s）Tab.1 Inhibitory effect of Xueshuantong for Injection on six kinds of CYP450 subenzymes（± s）

注：NA 为不适用。Note：NA ＝not applicable.

相对活性(% of NC)测试浓度（%）阴性对照阳性对照0.01 0.1 0.5 1 10 20 IC50（%）95% CI（%）CYP1A2 100.00±5.12 36.70±2.22 111.00±9.17 108.00±5.03 105.00±6.19 111.00±4.38 123.00±6.72 103.00±26.7 NA NA CYP2C9 100.00±2.69 14.50±0.50 99.30±1.97 102.00±1.29 103.00±4.54 100.00±3.53 93.50±1.88 97.30±2.83 NA NA CYP2E1 100.00±6.37 30.20±2.23 170.00±6.52 174.00±3.70 163.00±6.38 181.00±2.30 231.00±5.00 229.00±7.17 NA NA CYP2C19 100.00±3.28 24.20±1.27 102.00±4.52 113.00±4.41 113.00±12.00 115.00±0.74 76.50±7.14 51.40±4.17＞20 NA CYP2D6 100.00±3.29 6.69±0.31 107.00±3.89 107.00±0.93 104.00±2.20 97.30±5.28 80.20±1.18 67.50±2.20＞20 NA CYP3A4 100.00±4.09 4.43±0.08 94.90±1.35 102.00±5.73 110.00±5.85 95.80±5.29 53.00±1.27 28.00±1.34 10.70(8.74，13.00)

2.2 注射用血栓通与阿托伐他汀体外相互作用

结果见表2 和图2。结果显示，注射用血栓通在阿托伐他汀和CYP3A4 孵育体系中，对阿托伐他汀抑制作用的IC50为1.76%，即抑制阿托伐他汀50%的代谢时，注射用血栓通的浓度为1.76%。

图2 注射用血栓通对CYP3A4 的抑制曲线（按阿托伐他汀母体剩余率）Fig.2 Inhibition curve of Xueshuantong for Injection on CYP3A4（according to maternal residual rate of atorvastatin）

表2 注射用血栓通通过CYP3A4 亚酶对阿托伐他汀代谢的影响Tab.2 Effect of Xueshuantong for Injection on metabolism of atorvastatin via CYP3A4 subenzyme

3 讨论

本研究中，首先评估了注射用血栓通在人肝微粒体体外孵育体系中对CYP450 常见的6 种亚酶的抑制作用，结果显示，注射用血栓通对CYP3A4 酶活性的IC50最低，为10.7 %。在此基础上，进一步考察了注射用血栓通在上述孵育体系中对阿托伐他汀代谢的影响，结果显示，注射用血栓通对阿托伐他汀体外代谢的IC50为1.76%（按阿托伐他汀的母体剩余率计）。

CYPP450 酶系是体内药物代谢的主要酶系，超过90%的药物经CYP 酶代谢，其中涉及药物代谢的主要有CYP1，CYP2，CYP3 三大家族，其中CYP3A 家族中的CYP3A4 占 肝 内CYP 总 量 的30% ～40%[8，18－19]。CYP3A 作为在肝脏中表达最重要的酶，据统计，超过30%的上市药品在体内的代谢都主要由其催化[20]。注射用血栓通的主要成分为三七总皂苷，主要包括二醇型人参皂苷Rb1、三醇型人参皂苷Rg1、三醇型三七皂苷R1 等[21]。石杰等[22]报道了血塞通注射剂（黑龙江珍宝岛制药公司）对CYP3A4 酶活性无影响，而韩永龙等[23]和李晓宇等[24]报道了三七总皂苷（血塞通注射剂，昆明制药公司）对大鼠肝CYP3A4 酶活性有抑制作用。王凌等[25]则从单体角度研究了三七总皂苷的不同成分对CYP3A4 酶活性的影响，结果显示，R1 呈剂量依赖地抑制CYP3A4 酶活性，Rg1 不抑制CYP3A4 酶活性，Rb1在浓度为1 000 μmol／L 时可轻微抑制CYP3A4 酶活性，即临床正常剂量下Rg1 和Rb1 成分对CYP3A4 酶活性无影响。本研究结果表明，所用注射用血栓通对人肝微粒体CYP3A4 酶活性抑制作用呈浓度依赖性。综上可知，含三七总皂苷的相关药品其对CYP3A4 酶活性的抑制作用可能和药品种类及三七总皂苷的各成分含量有关。由于此前关于注射用血栓通对CYP450 酶活性的影响鲜有报道，凸显本研究的必要性。

在第一阶段研究的基础上，研究了主要由肝脏中的CYP3A4 酶代谢的常用心血管药物阿托伐他汀钙与注射用血栓通的体外相互作用，结果表明，注射用血栓通可通过CYP3A4 酶活性而影响阿托伐他汀的代谢。由于阿托伐他汀在体内经CYP3A4 主要代谢为活性与本药相当的邻位和对位羟基衍生物[26]，若CYP3A4 酶活性被抑制，那么阿托伐他汀对羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶抑制活性的半衰期将有可能缩短。当然，其具体的临床意义还有待进一步深入研究，如对抑制常数（Ki）的测定、对时间依赖性抑制还是可逆性抑制的判断等[27]。

本研究中的注射用血栓通，主要是在患者住院期间使用。然而，目前以主要成分为三七总皂苷的同类上市产品还有血栓通胶囊、复方血栓通片／颗粒／胶囊／滴丸／软胶囊等（源自国家药品监督管理局数据）用来治疗相关慢病的口服剂型。另外，除阿托伐他汀外，CYP3A4 酶主要参与代谢的常见药品还有钙通道阻断剂、他克莫司、辛伐他汀、洛伐他汀、洛匹那韦／利托那韦、司唑仑、唑吡坦、卡马西平等[28]。有研究表明，某些中成药虽然短期使用不会对CYP450 酶产生明显的抑制作用，但长期应用则会产生CYP450 酶抑制或诱导作用[29]。这就提示长期使用当上述药品和血栓通系列制剂联合使用时，特别是长期联合使用时而引起的相关药品的疗效降低或产生蓄积都值得进一步关注和研究。

目前关于注射用血栓通大型上市后的安全性的研究已有开展[30]。但报道的ADR 尚缺乏药物相互作用方面的评估。本研究中初步显示了血栓通与相关药物联用时，具有发生基于药物相互作用ADR 的可能，但尚需要专门的大型研究来评估。