miR-181c-5p通过靶向NDRG2调节人胶质母细胞瘤生物学活性

王铁峰 王刚 牛占峰

(1海南省第二人民医院神经外科，海南 五指山 572299；2宁夏医科大学总医院神经外科)

人胶质母细胞瘤是常见的人脑内原发性恶性肿瘤，具有极高的发病率和死亡率〔1〕。当前已有多种能够治疗胶质瘤的方法，如药物治疗、手术治疗等，但仍具有一定的缺陷性，治疗效果不佳〔2，3〕。MicroRNA是一种广泛分布的内源性非编码蛋白质的小RNAs(约为22个核苷酸)，其特点是可以结合到mRNA的3′UTR端来发挥其负调控基因表达的作用〔4〕。现已证实，miRNA与肿瘤的发生发展具有紧密联系〔5〕。已有研究表明，miRNA在胶质瘤细胞中具有差异性表达，并在细胞的增殖、迁移、凋亡中扮演重要角色。miR-128通过靶向ARP5/Bmi-1/E2F-3a从而调节胶质母细胞瘤的增殖〔6〕。miR-328通过靶向ABCG2降低胶质母细胞瘤的耐药性〔7〕。miR-125a-5p通过靶向TAZ可抑制胶质母细胞瘤增殖并促进其进行分化〔8〕。miR-181c-5p也是miRNA家族中的一员，已有研究发现miR-181c-5p在多种疾病的发生中具有重要作用，LncRNA可通过miR-181c-5p竞争性结合从而调控巨噬细胞自噬〔9〕。miR-181c-5p通过调控白血病抑制因子从而调控高糖介导的人脐静脉内皮细胞功能障碍〔10〕。miR-181c-5p通过靶向SMAD7调节神经母细胞瘤的生物学活性〔11〕。但miR-181c-5p在胶质母细胞瘤中的表达及其调控机制目前还不清楚。本研究拟分析miR-181c-5p在胶质瘤细胞中的表达及对其生物学活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人胶质母细胞瘤细胞系U87购于美国ATCC公司；细胞培养基DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购于Sigma；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物科技公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；双荧光素酶报告检测试剂盒购于promega公司；NDRG2-3′UTR和NDRG2-3′UTR MUT由擎科生物有限公司设计；miR-181c-5p mimics及NC-mimics、 miR-181c-5p inhibitor及NC-inhibitor由上海吉玛制药公司设计并合成。CCK-8试剂盒购于上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板购于康宁；NDRG2、GAPDH等抗体购于碧云天生物。

1.2临床样本 从在医院进行手术治疗的胶质母细胞瘤患者中，收集30例神经胶质瘤组织样本及邻近的正常组织样本。组织离体后在液氮中进行快速冷冻，在使用临床样本实验前应对其进行苏木素-伊红(HE)染色鉴定。本研究已获得伦理委员会批准，并在取样时得到了患者许可。

1.3细胞培养与转染 人胶质母细胞瘤细胞系U87细胞在含有2.5%FBS、5%马血清的DMEM-F12培养基中，在37℃，5%CO2条件培养。每3天进行一次换液。当细胞处于对数生长期时即可用于进行其他生物学实验。

将处于对数生长期的U87细胞接种至6孔板中，每孔约2×105个细胞。然后使用转染效率稳定的脂质体转染试剂Lipofectamine 2000进行转染。根据实验设计，miR-181c-5p mimics组、miR-181c-5p inhibitor组、NC-mimics组、NC-inhibitor组及对照组分别将miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor及相对应的阴性对照(NC-mimics、NC-inhibitor)及等量的脂质体转染试剂分别转入U87细胞中，转染结束后在培养条件下进行72 h培养。

1.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 根据TRIzol Reagent 使用说明书操作提取人胶质母细胞瘤组织及U87细胞中的总RNA，然后按照逆转录试剂盒使用说明书将RNA逆转录为cDNA。miR-181c-5p：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAACA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；NDRG2：上游引物5′-CTGGAACAGCTACAACAACC-3′，下游引物5′-CCCCTCAGCTATAGACACCT-3′；GAPGH：上游引物5′-GGTGAAGGCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。按照说明书配制qRT-PCR体系，反应条件为95℃预变性30 s，40个循环扩增反应(95℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPGH为NDRG2内参，U6为miR-181c-5p的内参，2-△△Ct法计算miR-181c-5p、NDRG2的相对表达。

1.5Western印迹检测蛋白表达情况 使用组织/细胞裂解液对组织/细胞进行裂解，然后收集总蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。分别取20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转至聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，然后使用5%脱脂奶粉对其进行1 h封闭，使用1倍磷酸盐缓冲液(PBS)将膜清洗3次。加入相应的一抗置于4℃摇床过夜孵育，清洗后，加入二抗进行室温孵育1 h，清洗后加入ECL显影液显影。

1.6CCK-8检测细胞增殖 铺处于生长期的U87细胞至96孔板中，进行转染后培养48 h，然后向每个孔中加入10 μl CCK-8试剂并混匀，并设置空白对照。37℃下避光孵育1 h，使用酶标仪测定波长450 nm的吸光度值。

1.7Transwell检测细胞迁移和侵袭 取处于生长期的U87细胞至24孔板中，进行转染后培养48 h。使用胰酶消化U87细胞并用无血清培养基进行重悬，使用台盼蓝染色技术调整细胞密度为2×108/L，然后取细胞悬液100 μl加至Transwell小室上层向，Transwell小室下层中加入500 μl 10%血清完全培养基，37℃培养箱中避光培养24 h后取出小室，1倍PBS清洗后用棉签轻轻擦除上室中未发生迁移的细胞。用4%多聚甲醛固定20 min，1倍PBS清洗3次后使用0.1%结晶紫染色10 min，1倍PBS清洗后，随机选择5个视野，计数下室染色细胞。

将提前冻存的基质胶置于4℃直至溶成液态，使用400 μl无血清培养基对50 μl基质胶原液进行稀释并轻轻摇晃混匀。取50 μl稀释液加至Transwell小室的上室中，置于37℃培养箱中进行孵育，当凝固后加入100 μl无血清培养基浸润凝胶，吸弃，后续步骤与迁移实验相同。通过计数穿膜细胞数来反映细胞侵袭能力。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 取处于生长期的U87细胞至24孔板中，进行转染后培养48 h。使用不含EDTA的胰酶消化U87细胞并用无血清培养基进行重悬。1 000 r/min离心5 min，收集细胞，加入500 μl 1倍结合缓冲液对细胞进行重悬，再加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI并轻轻摇晃混匀，室温避光5 min后使用流式细胞术统计各组凋亡率。

1.9生物信息学预测miR-181c-5p的靶基因 通过生物信息学网站miRBD和targetscan联合预测miR-181c-5p的靶基因。

1.10双荧光素酶报告实验 取GIST-T1细胞制备成单细胞悬液，接种于96孔板，采用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000按说明书操作进行共转染，然后将细胞分为4组：野生型质粒对照组(转染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR)、野生型实验组(转染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR)、突变型质粒对照组(转染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR MUT)、突变型质粒实验组(转染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR MUT)。对其培养24 h后裂解细胞，并按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.11统计学方法 采用GRAPDprism6.0统计学软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1miR-181c-5p在胶质瘤组织中的表达 与正常组织(0.88±0.13)相比，神经胶质瘤组织中的miR-181c-5p(1.80±0.20)显著上调(P<0.01)。

2.2miR-181c-5p可以调控胶质母细胞瘤的生物学功能 与对照组相比，miR-181c-5p mimics组的U87细胞中miR-181c-5p显著增加(P<0.001)，而NC mimics组与对照组无明显差异(P<0.05)。与对照组相比，miR-181c-5p inhibitor组中miR-181c-5p表达显著降低(P<0.001)。见表1。

CCK-8实验结果显示，与对照组相比，miR-181c-5p mimics组的U87细胞吸光度显著增加(P<0.01)，而NC-mimics组与对照组没有显著差异性(P>0.05)；与对照组相比，miR-181c-5p-inhibitor组U87细胞吸光度显著下降(P<0.05)，而NC-inhibitor与对照组无明显差异(P>0.05)。

Transwell细胞迁移实验显示，与对照组相比，miR-181c-5p mimics组的U87细胞迁移率、侵袭率显著上升(P<0.01,P<0.05)，而NC组与对照组没有显著差异性(P>0.05)；与对照组相比，miR-181c-5p-inhibitor组U87细胞迁移率、侵袭率显著下降，而NC-inhibitor与对照组没有显著差异性(P>0.05)。见表1、图1、图2。与对照组相比，miR-181c-5p mimics组的U87细胞凋亡率下降(P<0.01)，而NC-mimics组与对照组没有差异性(P>0.05)；与NC-inhibitor组相比，miR-181c-5p-inhibitor组U87细胞凋亡率增加(P<0.01)，而NC-inhibitor与对照组没有差异性(P>0.05)。见表1、图3。

图1 细胞迁移实验(结晶紫染色，×40)

图2 细胞侵袭实验(结晶紫染色，×40)

图3 流式细胞术检测U87细胞凋亡

表1 miR-181c-5p可调控胶质瘤细胞U87的生物学活性

2.3miR-181c-5p的靶基因 通过生物信息学在线分析软件miRbase和Targetscan预测miR-181c-5p的靶基因，结果显示NDRG2可能是miR-181c-5p的靶基因，存在互补的结合位点(图4)。通过双荧光素酶报告实验显示，miR-181c-5p mimics组NDRG2 3′UTR的相对荧光素酶活性明显受到抑制，而NDRG2 3′UTR MUT的相对荧光素酶活性没有明显的抑制作用。见表2。

表2 双荧光素酶报告实验分析miR-181c-5p与NDRG2间的靶向结合作用

图4 miR-181c-5p与NDRG2间的结合序列

2.4miR-181c-5p对NDRG2基因的表达调控 与对照组相比，U87细胞中转染miR-181c-5p mimics后可显著下调NDRG2 mRNA表达和蛋白表达。而NC-mimics组与对照组没有差异性(P>0.05)；与对照组组相比，U87细胞中转染miR-181c-5p-inhibitor可上调NDRG2 mRNA表达和蛋白表达，而NC-inhibitor与对照组没有差异性(P>0.05)。见图5、表3。

图5 Western印迹检测NDRG2蛋白表达

表3 qRT-PCR检测miR-181c-5p mimics、NC-mimics转染后NDRG2 mRNA表达

3 讨 论

人胶质母细胞瘤是常见的脑部恶性肿瘤之一，其复发性高，死亡率高。已通过分子生物学、遗传学、病理学等方法的结合对其进行了探究，为临床治疗该疾病提供了许多价值资料。

miRNA是一种约22个核苷酸组成的内源性非编码蛋白质的小RNAs，与肿瘤的发生发展具有密切关系〔12〕。能够通过与靶基因的mRNA 3′UTR区域直接结合进而调控肿瘤发生中的生物学活性，如细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡等〔13，14〕。研究表明，多种miRNA在GSM发生发展中更具有重要作用，如miR-181d〔15〕、miRNA-154-5p〔16〕、miR-21〔17〕、miR-429〔18〕等。本研究与前期研究结果一致〔19〕，表明miR-181c-5p在胶质母细胞瘤发生发展过程中具有重要作用。在U87细胞中进一步通过实验证实，miR-181c-5p的表达可促进细胞增殖、迁移及侵袭且抑制细胞凋亡。通过生物信息学在线分析网站预测出NDRG2是miR-181c-5p的靶基因，能够与NDRG2 3′UTR区域结合而影响生物学活性。并通过双荧光素酶实验证实miR-181c-5p可以直接结合NDRG2 3′UTR区域且这种结合是靶向抑制的。研究表明NDRG2作为NDRG家族的重要成员，在参与组织胚胎发育、细胞分化及血液免疫中具有重要作用，同时也与肿瘤的发生密切相关〔11，20～24〕。Deng等〔25〕研究表明在胶质瘤中NDRG2表达下调，与本研究结果一致。

综上，miR-181c-5p通过靶向抑制NDRG2的表达，进而调节人胶质细胞瘤的生物学活性。miR-181c-5p成为治疗胶质母细胞瘤的潜在靶点。