miR-654靶向FHIT对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制

郭丽 赵虹 张俊涛 刘志贞 弓韬 梁文婷 刘畅 孙公勤 于保锋

(1临汾职业技术学院，山西 临汾 041000；2山西医科大学生物化学与分子生物学教研室；3山西大学环境科学研究所)

原发性肝癌是世界常见高发恶性肿瘤，进展快、预后差，其治疗方法包括肝切除术和肝移植术，但多数患者发现时已是晚期，难治愈；探寻新的有效治疗药物及手段对肝癌治疗有重要意义，分子靶向治疗为肝癌的治疗提供了新的手段〔1,2〕。microRNA(miR)是一类仅有20～24 nt核苷酸的小RNA分子，可在转录后调控靶基因，且可影响肝癌细胞的恶性病理过程〔3〕。研究发现miR-654-3p可能调节转移性前列腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭〔4〕。miR-654-5p通过抑制骨形态发生蛋白(BMP)2调控人骨髓基质干细胞成骨分化〔5〕。有研究发现miR-654在肝癌中上调表达，但目前miR-654对肝癌生物学行为的影响还不清楚。脆性组氨酸三联体(FHIT)定位于染色体3p14.2，是一个肿瘤抑制基因，在多种恶性肿瘤及肝癌中表达减少和缺失〔6〕。研究报道过表达FHIT可诱导肝癌细胞凋亡并导致其发生G1期阻滞从而抑制肿瘤细胞生长〔7〕。本实验通过转染miR-654和FHIT的抑制表达载体至肝癌细胞HepG2中，研究其对肝癌细胞的影响；同时研究miR-654和FHIT之间的靶向关系，旨在研究miR-654对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制是否与FHIT有关。

1 材料与方法

1.1患者组织和肝癌细胞来源 选取山西医科大学附属山西白求恩医院收治的肝癌患者，手术取其肝癌组织和癌旁组织，所有患者术前未进行放化疗，均知情同意。肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂 RPMI1640培养基购自武汉益普生物公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海抚生实业有限公司；RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、钙黏附蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、FHIT、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG购自北京博奥森生物科技有限公司；Transwell小室、基质胶购自上海代轩生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养与分组 肝癌细胞HepG2用RPMI-1640培养基培养，取对数生长期细胞，将miR-654抑制剂及阴性对照转染至HepG2细胞，计为anti-miR-654组、anti-miR-NC组；将miR-654抑制剂分别与FHIT干扰载体及阴性对照共转染至HepG2细胞，计为anti-miR-654+si-FHIT组、anti-miR-654+si-NC组。

1.3.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-654表达水平 取适量肝癌组织、癌旁组织及收集anti-miR-NC组、anti-miR-654组的HepG2细胞，加入Trizol试剂提取其总RNA，合成cDNA后U6为内参进行PCR，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.3.3MTT检测细胞增殖活性 anti-miR-NC组、anti-miR-654组、anti-miR-654+si-NC组、anti-miR-654+si-FHIT组细胞培养至24 h、48 h、72 h时，分别加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μl二甲基亚砜，振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集anti-miR-NC组、anti-miR-654组、anti-miR-654+si-NC组、anti-miR-654+si-FHIT组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞后用结合缓冲液进行重悬；然后加入Annexin V-FITC和PI，反应后上流式细胞仪检测。

1.3.5Western印迹检测蛋白表达水平 收集anti-miR-NC组、anti-miR-654组、anti-miR-654+si-NC组、anti-miR-654+si-FHIT组细胞，提取总蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，封闭；加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，显影，定影，分析蛋白条带灰度值。

1.3.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 取anti-miR-NC组、anti-miR-654组、anti-miR-654+si-NC组、anti-miR-654+si-FHIT组细胞，用无血清培养液重悬，取200 μl细胞悬液接种于Transwell上室，下室加入含趋化因子的培养液，置于培养箱中培养24 h，弃去培养液，将细胞用4%多聚甲醛固定30 min，再加入结晶紫染色，漂洗干燥，用显微镜拍照并计数，即为迁移细胞数。侵袭实验用基质胶平铺覆盖Transwell上室，然后同迁移操作。

1.3.7荧光素酶报告实验 将FHIT 野生型和突变型荧光素酶表达载体(WT-FHIT和MUT-FHIT)分别与miR-NC和miR-654共转染至HepG2细胞中，依据说明书要求操作，检测荧光素酶活性。将anti-miR-NC、anti-miR-654、miR-NC、miR-654分别转染至HepG2细胞中，用Western印迹检测FHIT蛋白表达水平。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-654在肝癌组织中的表达 肝癌组织中miR-654表达水平(0.78±0.12)显著高于癌旁组织(0.18±0.03，P<0.05)。

2.2抑制miR-654对细胞HepG2增殖、凋亡的影响 转染anti-miR-NC、anti-miR-654后，anti-miR-654组miR-654的表达水平显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，表明转染成功；anti-miR-654组48及72 h细胞活性及CyclinD1、Bcl-2表达水平显著低于anti-miR-NC组，而细胞凋亡率和p21、Bax表达水平显著高于anti-miR-NC组(均P<0.05)，见图1，图2，表1。

图1 抑制miR-654对细胞HepG2凋亡的影响

1～2：anti-miR-NC组，anti-miR-645组图2 抑制miR-654对细胞HepG2增殖、凋亡蛋白表达的影响

表1 抑制miR-654对细胞增殖凋亡的影响

2.3抑制miR-654对细胞HepG2迁移、侵袭的影响 anti-miR-654组HepG2细胞的迁移和侵袭数目、MMP-2表达水平均显著低于anti-miR-NC组，而E-cadherin的表达水平显著高于anti-miR-NC组(均P<0.05)，见图3，表2。

1～2:anti-miR-NC组，anti-miR-654组图3 抑制miR-654对迁移、侵袭蛋白E-cadherin和MMP-2表达的影响

表2 抑制miR-654对细胞迁移侵袭的影响

2.4miR-654靶向、调控FHIT TargetScan预测显示FHIT与miR-654存在结合位点。见图4。WT-FHIT与miR-654共转染后HepG2细胞的荧光素酶活性显著低于WT-FHIT与miR-NC共转染的细胞(P<0.05)，见表3。miR-654组FHIT表达水平(0.08±0.01)显著低于miR-NC组(0.25±0.03，P<0.05)；anti-miR-654组FHIT表达水平(0.67±0.05)显著高于anti-miR-NC组(0.23±0.02，P<0.05)。见图5。

图4 FHIT与miR-654的互补序列

表3 双荧光素酶报告实验

1,2：miR-NC组，miR-654组图5 FHIT蛋白的表达水平

2.5抑制FHIT能逆转抑制miR-654对细胞HepG2增殖、凋亡的作用 anti-miR-654+si-FHIT组48及72 h细胞活性及CyclinD1、Bcl-2表达水平显著高于anti-miR-654+si-NC组，而细胞凋亡率及FHIT、p21、Bax表达水平显著低于anti-miR-654+si-NC组(均P<0.05)，见图6、表4。

1，2：anti-miR-654+si-NC,anti-miR-654+si-FHIT组图6 抑制FHIT能逆转抑制miR-654对细胞HepG2增殖、凋亡蛋白表达的影响

表4 抑制FHIT能逆转抑制miR-654对细胞增殖凋亡的作用

2.6抑制FHIT能逆转抑制miR-654对细胞HepG2迁移、侵袭的作用 anti-miR-654+si-FHIT组HepG2细胞迁移和侵袭数目及MMP-2表达水平显著高于anti-miR-654+si-NC组，E-cadherin表达水平显著低于anti-miR-654+si-NC组(均P<0.05)，见表5、图7。

表5 抑制FHIT能逆转抑制miR-654对细胞迁移侵袭的作用

1～2:anti-miR-654+si-NC组,anti-miR-654+si-FHIT组图7 抑制FHIT和miR-654对细胞HepG2迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

肝癌有恶性程度高、起病隐匿、进展快等特点，术后复发率高〔8〕。研究发现miRNA与肝癌的发生发展密切相关，可作为诊断、预后的生物标志物及治疗靶点〔9，10〕。有研究报道miR-654-5p在乳腺癌组织和细胞系中下调表达，其低表达与晚期TNM分期和淋巴结转移密切相关，miR-654-5p过表达通过靶向上皮基质相互作用(EPSTI)1基因抑制细胞生长和侵袭，并诱导乳腺癌细胞凋亡〔11〕。miR-654-5p在晚期口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者中上调并且与OSCC患者的不良预后相关；可促进OSCC的增殖，转移〔12〕。本研究结果表明抑制miR-654可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，而促进细胞凋亡。

CyclinD1和p21均是细胞周期相关蛋白，CyclinD1高表达可导致细胞过度增殖促进肿瘤的发生，p21是抑癌基因，可抑制细胞的异常生长〔13〕。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的关键因子，Bax促凋亡，Bcl-2抑凋亡。E-cadherin主要维持细胞间的黏附作用，其下调表达细胞间黏附性降低；MMP-2与细胞的侵袭转移密切相关〔14〕。本研究结果说明抑制miR-654表达可通过调控相关蛋白的表达进而影响肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。

目前，FHIT广泛被认为是一种抑癌基因蛋白，能诱导细胞凋亡，抑制细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖，异常低表达与多种肿瘤进展相关〔15〕。FHIT在原发性肝癌中低表达，参与了肝癌细胞的增殖与凋亡调控过程〔16〕。转染FHIT可增强人肝癌细胞HepG2辐射敏感性〔17〕。FHIT还可诱导肺癌自噬促进细胞凋亡〔18〕。

综上，抑制miR-654表达可能通过调控FHIT表达抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。