miR-22在老年脓毒症急性肾损伤中的作用及机制

王旭东 王亚丽 郭毅 陈超 袁青文 杨建平

(1苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006；2徐州医科大学第二附属医院)

脓毒症是因感染诱发的全身炎症反应综合征，研究发现，本病发病机制与发展过程较为复杂，在病情进展中易伴脓毒症休克，危重患者常伴多器官功能障碍综合征，目前是危重病医学中的难题〔1〕。临床中，急性肾损伤(AKI)是脓毒症患者最常见的并发症，脓毒症型AKI致死率高，目前尚无能够有效评估病情的指标〔2〕。微小RNA(miRNA)作为内源性基因编码的长度为21～23个核苷酸的非编码单链RNA分子，是直接由核苷酸酶DiceR剪切加工而成，在编码蛋白质中并未见作用〔3〕。研究报道其作用是直接通过特定靶基因的3′-非编码区调控功能基因表达，使机体不同病理生理进程受调节。近年来脓毒症深入研究结果指出miRNA具有关键的调控作用，且特异miR-22是评估脓毒症患者诊断与预后的无创生物学指标，但具体对脓毒症AKI患者的调控作用报道较少〔4，5〕。故本研究重点对miR-22在老年脓毒症AKI中的作用及机制展开探讨，期望确定miR-22在脓毒症中的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月至2018年3月徐州医科大学第二附属医院ICU收治的老年脓毒症患者60例作为研究对象，按照《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》〔6〕每天评估患者是否发生AKI，以入选后7 d中是否发生AKI分为非AKI组(28例)与AKI组(32例)；纳入标准：(1)所有入选患者符合《2001年国际脓毒症定义会议关于脓毒症诊断的新标准》〔7〕中脓毒症诊断标准；而AKI组符合《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》中AKI诊断标准；(2)年龄65～74岁；排除标准：(1)有肾移植手术史者；(2)患终末期肾脏疾病者；(3)肾脏替代治疗前入住过 ICU者；(4)已明确或疑似患肾小球肾炎、间质性肾炎、肾血管炎者；(5)梗阻引起的 AKI患者；(6)患肾脏肿瘤者；(7)低血容量性休克者；(8)心脏功能不全者、患甲状腺疾病者。AKI组年龄65～74岁，平均年龄(66.67±2.85)岁；男21例，女11例；非AKI在年龄65～74岁，平均年龄(66.02±2.12)岁；男性18例，女性10例；两组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)；本研究经医院伦理委员会批准，且入选患者皆为自愿参与本研究，签署知情同意书。

1.1.1脓毒症诊断标准 根据《2001年国际脓毒症定义会议关于脓毒症诊断的新标准》，确诊或疑似为感染者伴全身炎症反应综合征(SIRS)。SIRS满足以下2项以上即可诊断：①体温超过38℃或低于36℃；②心率每分钟超过90次，不包括给予降心率药物或装置起搏器者；③呼吸每分钟超过20次，或动脉血氧二氧化碳分压(PaCO2)<32 mmHg，或机械通气；④白细胞计数>12×109/L或<4×109/L，或幼稚细胞(杆状核)>10%。

1.1.2AKI诊断标准 参照《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》相关内容制定：48 h内血清肌酐(SCr)升高26.4 μmol/L(0.3 mg/dl)或≥50%；或尿量<0.5 ml/(kg·h)，连续6 h以上。

1.2方法 收集所有入选患者的基本资料：包括体温、呼吸频率、心率、收缩压、舒张压、中性粒细胞百分比(NEUT%)、血小板计数(PLT)、急性生理与慢性健康(APACHE Ⅱ)评分、全身性感染相关性器官衰竭(SOFA)评分、脑钠肽(BNP)、氧合指数、ICU滞留时间及平均住院天数等。APACHE Ⅱ评分最高为71分，分数越高表明预后效果越差〔7〕；SOFA评分最高为24分，分数越高表明预后效果越差〔8〕。

1.2.1样本的采集 所有入选患者在达到相应诊断标准入ICU后24 h内采集晨起空腹外周静脉血液5 ml与尿液标本5 ml；本研究所使用的患者血液样本均由徐州医科大学第二附属医院ICU提供。采血管均已事先进行去RNA酶处理；采用荧光定量PCR检测所有血清样本中miR-22的表达水平；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清样本中高迁移率族蛋白(HMG)B1的含量、全自动生化分析仪测定SCr、胱抑素(Cys)-C水平。尿液标本经2 000 r/min常温离心20 min后获取上清液密封，每份编号后存放于-20℃冰箱中，采用ELISA试剂盒和全自动生化分析仪测定尿液肾损伤分子(KIM)-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平。

1.2.2细胞转染 采用生物学软件预测miR-22的靶基因，分别构建HMGB1 3′UTR野生型(WT)和HMGB1 3′UTR突变型(Mut)质粒载体并将之分别与miR-22 mimic共转染肾细胞(人肾母细胞G401，北京协和细胞资源中心)。

1.2.3采用荧光素酶法检测 HMGB1蛋白表达：细胞转染24 h后，采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗24孔板中培养液2遍，避免出现PBS残留，将各孔中置入裂解液，取1.5 ml细胞放入新EP管并置入在4℃环境中离心3 min，上机读数并应用发光检测仪测定荧光素酶底物活性，取数值A后，再向管中添加Stop液100 μl，取数值B，计算荧光活性，重复3次取平均值。

1.2.4Western印迹检测法 miR-22 mimic转染肾细胞HMGB1 24 h，添加100 mg∶1 ml的强裂解液，5%脱脂牛奶封闭1 h后，一抗4℃中过夜；二抗室温孵育1 h，电化学发光(ECL)试剂发光显影，以内参GAPDH条带作为目的蛋白相对表达水平作为参照。

1.3观察指标 观察两组患者血清中miR-22表达水平，根据miR-22不同表达水平分析与脓毒症AKI的临床参数关系(ScR、Cys-C、KIM-1、NGAL与血清HMGB1含量水平；miR-22靶向基因表达情况、miR-22调节脓毒症急性肾损伤细胞中HMGB1 mRNA蛋白表达。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组常规指标比较 AKI组APACHE Ⅱ、SOFA、BNP高于非AKI组，ICU滞留时间、住院天数短于非AKI组；而AKI组氧合指数低于非AKI组，组间差异具有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 两组常规指标比较

2.2两组血清中miR-22表达水平 AKI组miR-22表达水平显著高于非AKI组，差异具有统计学意义(1.34±0.39 vs 1.02±0.35;t=3.325,P=0.002)。

2.3miR-22不同表达水平与脓毒症急性肾损伤临床病理参数的关系 AKI组中32例患者血清中miR-22相对表达量进行对数变换，其平均增高倍数(5.20倍)作为节点，把miR-22水平分为低表达组(18例)与高表达组(14例)，低表达组SCr、Cys-C、KIM-1显著低于高表达组，而低表达组NGAL显著高于高表达组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-22的表达水平与脓毒症急性肾损伤临床病理参数的关系

2.4各组血清HMGB1含量水平 高表达组中HMGB1水平〔(137.63±24.95)ng/ml〕显著高于低表达组与非AKI组〔(105.27±16.95)ng/ml、(98.74±15.97)ng/ml；P<0.05〕；而低表达组血清HMGB1含量水平明显高于非AKI组(P<0.05)。

2.5miR-22靶向基因表达 与转染miR-22 mimic和 HMGB1 3′UTR Mut的非AKI组比较，低表达组与高表达组转染miR-22 mimic与 HMGB1 3′UTR Mut人肾母细胞中荧光酶活性下降(P<0.05)；但3组转染miR-22 mimic与HMGB1 3′UTR WT的脓毒症急性肾损伤细胞中荧光酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组转染HMGB1 3′UTR WT和HMGB1 3′UTR Mut后miR-22表达比较

2.6miR-22调节脓毒症急性肾损伤中HMGB1蛋白表达 与转染的非AKI组(1.56±0.20)比较，低表达组(1.37±0.41)、高表达组HMGB1蛋白表达(1.14±0.20)明显下降(t=6.951、2.032；P=0.000、0.049)，且高表达组HMGB1蛋白明显低于低表达组(t=2.088；P=0.045)，见图1；细胞中荧光素酶结果发现，高表达组中HMGB1蛋白相应的荧光强度(1.63±0.35)显著高于低表达组(1.27±0.42)与非AKI组(1.30±0.39；t=2.582、2.671；P=0.015、0.011)，见图2。提示miR-22可调控HMGB1蛋白翻译过程，从而下调HMGB1蛋白表达。

图1 HMGB1蛋白检测

A、B、C依次是：蓝光激发细胞核荧光、绿光激光靶向蛋白荧光、自然光下细胞图2 3组肾细胞中HMGB1蛋白表达荧光素酶检测结果

3 讨 论

miRNA中的miR-22是一种微小内源性非编码的小RNA分子，miR-22具有广泛生物学效应，经过特定的信号通路作用脓毒症与并发症发生环节〔8，9〕。文献报道采用二代测序技术对脓毒症患者血清中miR-22表达与正常群体进行对比检测，结果发现脓毒症患者的血清miR-22表达显著生升高，进一步研究发现，miRNA是在炎症反应、细胞凋亡等关键病理生理过程中具有调控作用的功能性基因，说明在脓毒症致病过程中miRNA调控网络有关键作用〔10～12〕。

急性肾损伤作为脓毒症中发病率较高的并发症之一，炎症因子大量释放与足细胞侵损是关键致病机理，而miR-22在并发过程中具有调节作用〔13〕。Tang等〔14〕研究发现，脓毒症患者外周循环血清中miR-22水平表达显著升高，尤其是脓毒症AKI患者miR-22表达水平明显高于非AKI患者，应用基因组数据库研究结果发现，miR-22主要对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、兔尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5靶向表达调控，对脓毒症相关的急性肾损伤患者肾脏组织能量代谢、氧化应激、线粒体功能紊乱、肾小管细胞侵损等均有作用。Cys-C属于糖基化小分子蛋白，在血中生成量稳定，且无其他影响因素，个体间变异率小，其浓度与内生Scr清除率呈负相关，是临床反映肾小球滤过率的同源性标志物〔15～17〕。KIM-1作为新型跨膜糖蛋白，常见于肾损伤的近端肾小管上皮细胞内，对肾前性氮质血症存在良好的特异性与敏感性，且慢性肾病或尿路感染不会对其造成影响〔18〕。NGAL通常不常见于肾组织中，但发生缺血性损伤后，肾小管升支段分泌功能升高，NGAL大量出现，尿液中NGAL浓度骤增，说明miR-22能下调Cys-C、Scr、KIM-1水平；上调NGAL可加重肾小管细胞侵损，加快刺激脓毒症急性肾损伤进程变化〔19〕。HMGB1作为新的晚期炎症介质，在脓毒症患者病情受炎症以你这刺激或细胞发生应激反应后大量释放、分泌，与不同炎症介质共同作用，让机体炎症范围扩散，致脓毒症患者发生脏器功能损伤，常见为AKI〔20〕。本研究提示miR-22高表达组中HMGB1呈高表达。本研究结果提示miR-22可调控HMGB1 mRNA翻译过程，从而下调HMGB1蛋白表达。