circ_0011460调控miR-145对子痫前期滋养细胞生物行为的影响

赵 丹，安 杰，刘 倩，李 力，朱清华

子痫前期(preeclampsia, PE)是一种常见的妊娠相关综合征，以高血压和蛋白尿为特征，是孕产妇和围产儿死亡的主要原因。在正常妊娠期间，滋养细胞获得类似肿瘤的特性并侵入子宫内膜和血管系统，这是胎盘形成、植入的关键步骤，然而PE胎盘中滋养层细胞未能正常侵入子宫[1]。因此，研究滋养层细胞迁移侵袭的分子机制，对了解PE发病机制及开发新的治疗策略非常关键。环状RNA(circRNA)是由前体RNA通过反向剪切形成的，具有共价闭合环结构的RNA分子，其通过与靶微小RNA(miRNA)结合、调节亲本基因表达、与RNA结合蛋白相互作用等方式发挥生物学功能，在肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、PE等疾病发生、进展中具有重要调控作用[2]。Deng等[3]通过RNA-Seq鉴定和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)证实，重度PE胎盘组织中circRNA 0011460(circ_0011460)表达上调，可能是该类患者潜在的治疗靶点。靶基因预测显示，miR-145是circ_0011460的潜在靶点。有研究指出，PE患者胎盘组织中miR-145表达降低，过表达miR-145可提高滋养细胞增殖率，降低细胞凋亡率[4]。因此，本研究假设circ_0011460可能靶向miR-145参与调控滋养细胞生物学行为；分析了circ_0011460、miR-145在正常胎盘、PE胎盘组织中表达，探讨干扰circ_0011460表达对滋养细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并以miR-145为切入点探讨其分子机制，旨在为PE治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2018年10月—2019年12月于本院行剖宫产的39例PE患者的胎盘组织为PE组。排除标准：原发性高血压病、妊娠糖尿病、多胎妊娠、染色体异常、先天性畸形或怀疑围产期感染的孕妇。并取同期在我院进行剖宫产的39例健康孕妇的正常胎盘组织为对照组(NC组)。2组均在剖宫产后10 min内获得胎盘组织，切成1 cm3组织块，保存于-80℃备用。该研究得到本院伦理委员会的批准。

1.2细胞和试剂 人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞购于中国科学院上海细胞库；PrimeScript逆转录Master Mix试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购于大连Takara公司；miRNA检测试剂盒购于美国GeneCopoeia公司；circ_0011460的小干扰RNA(si-circ_0011460)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、miR-145模拟物(miR-145)、miRNA模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-145抑制物(anti-miR-145)、miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、荧光素酶报告质粒均购自广州锐博生物公司；双重荧光素酶报告试剂盒购自北京全式金生物公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)购于上海弗元生物公司；包被基质胶Transwell小室购于北京优尼康公司；山羊抗兔IgG二抗(ab205718)、N-cadherin兔单克隆抗体(ab40772)、N-cadherin兔单克隆抗体(ab76011)、兔多克隆抗体(ab9485)均购于美国Abcam公司。

1.3RT-qPCR检测circ_0011460和miR-145表达 TRIzol试剂提取2组胎盘组织总RNA，逆转录采用PrimeScript逆转录Master Mix试剂盒，然后采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测circ_0011460进行RT-qPCR。利用miRNA检测试剂盒对miR-145进行反转录和RT-qPCR。GAPDH作为circ_0011460的内参，U6作为miR-145的内参。2-ΔΔCt法计算circ_0011460和miR-145相对表达量。circ_0007611引物序列(上游5'-CTGGGGTGGTAAAACTTGGAGA-3'，下游5'-CTAATGTATTATAGCCCATATCCGG-3')；GAPDH(上游5'-ATCATCCCTGCCTCTACTGG-3'，下游5'-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3')；miR-145(上游5'-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3'，下游5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3')；U6(上游5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3')。

1.4细胞培养和实验分组 将HTR-8/SVneo细胞在补充10%胎牛血清的RPMI 1640溶液中进行培养，该培养基补充有1%青霉素-链霉素双抗，放入37℃、5%CO2中的培养箱中培养，当细胞达到70%～80%融合胰酶消化传代。将对数期的HTR-8/SVneo细胞按照每孔3×105个接种于6孔板上，培养24 h后，利用Lipofectamine 3000将100 nmol/L的si-NC、si-circ_0011460、miR-NC、miR-145 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-145、si-circ_0011460+anti-miR-145分别转染HTR-8/SVneo细胞，分为si-NC组、si-circ_0011460组、miR-NC组、miR-145组、anti-miR-NC组、anti-miR-145组、si-circ_0011460+anti-miR-145组。转染48 h，RT-qPCR检测转染效果后进行后续实验。

1.5双荧光素酶报告实验 Circular RNA Interaction数据库预测到miR-145与circ_0011460存在特异性集合位点。将含有miR-145结合位点序列的circ_0011460野生型(wt)荧光素酶报告质粒wt-circ_0011460或突变型(mut)荧光素酶报告质粒mut-circ_0011460分别与miR-145 mimics、miR-NC共转染HTR-8/SVneo细胞，48 h后采用双重荧光素酶报告试剂盒检测各组细胞相对荧光素酶活性。

1.6CCK-8法检测细胞活力 将转染48 h的细胞以5×103个/孔接种于96孔板，并分别培养24、48、72 h。然后，向每个孔中加入10 μl的CCK8溶液，然后在37℃下孵育1.5 h。使用酶标仪测量450 nm处的光密度(OD)值。

1.7划痕愈合实验检测细胞迁移 将转染48 h细胞以1×105个/孔接种24孔板，37℃孵育过夜。用10 μl移液器枪头尖端在细胞表面划一直线。RPMI 1640培养基轻轻清洗漂浮细胞2次，显微镜下测量划痕距离记为划痕距离0 h，培养24 h后，显微镜下测量划痕距离记为划痕距离24 h，划痕愈合率=(划痕距离0 h-划痕距离24 h)/划痕距离0 h×100%。

1.8Transwell实验检测细胞侵袭 用无血清培养基将转染48 h HTR-8/SVneo细胞密度调节至每毫升1×105个。将100 μl细胞悬浮液添加至Transwell室的上室，将500 μl包含20%胎牛血清的培养基添加至下室。培养箱孵育24 h，用棉签除去Transwell膜上表面细胞和基质胶。用10%甲醛固定Transwell膜底部表面细胞10 min，0.1%结晶紫染色20 min。倒置显微镜下随机选择5个视野细胞数均值表示细胞侵袭能力。

1.9蛋白免疫印迹检测N-cadherin、E-cadherin蛋白表达 收集各组HTR-8/SVneo细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤一次，加入RIPA裂解缓冲液获得细胞总蛋白。制备12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，每泳道上样40 μg蛋白，90 V恒压电泳分离蛋白，然后转膜至聚偏二氟乙烯膜。在室温下将膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后吸尽封闭液。加入一抗溶液E-cadherin(1∶10 000)、N-cadherin(1∶5000)、GAPDH(1∶2500)在4℃下孵育过夜。用1∶2000稀释的二抗室温孵育2 h。通过化学发光检测蛋白条带，GAPDH作为内参，使用Image J软件测定目的条带的相对灰度值。

2 结果

2.1circ_0011460和miR-145在正常胎盘和PE胎盘组织中的表达水平及相关性 NC组和PE组的circ_0011460表达量分别为0.98±0.17、3.47±0.21，miR-145相对表达量分别为1.01±0.15、0.30±0.05。与NC组比较，PE组circ_0011460相对表达量显著升高，miR-145相对表达量显著降低(P<0.01)。circ_0011460与miR-145相对表达量呈负相关(r=-0.9547，P<0.01)。见图1。

图1 circ_0011460和miR-145在NC组和PE组胎盘组织中的表达及相关性

2.2不同处理HTR-8/SVneo细胞中circ_0011460和miR-145表达水平比较 HTR-8/SVneo细胞circ_0011460相对表达量分别为si-NC组1.00±0.00、si-circ_0011460组0.16±0.01。si-circ_0011460组circ_0011460相对表达量显著低于si-NC组(P<0.01)。HTR-8/SVneo细胞miR-145相对表达量分别为miR-NC组1.00±0.00、miR-145组3.56±0.11、anti-miR-NC组1.00±0.00、anti-miR-145组0.27±0.02，miR-145组miR-145相对表达量显著高于miR-NC组(P<0.01)。HTR-8/SVneo细胞miR-145相对表达量anti-miR-145组显著低于anti-miR-NC组(P<0.01)。见图2。

图2 不同处理HTR-8/SVneo细胞中circ_0011460和miR-145表达水平比较

2.3circ_0011460和miR-145靶向关系的检测 Circular RNA Interaction数据库预测miR-145与circ_0011460存在特异性结合核苷酸序列。与si-NC组比较，si-circ_0011460组HTR-8/SVneo细胞miR-145表达水平显著增加(P<0.05)，见图3。同与wt-circ_0011460共转染，miR-145组细胞相对荧光素酶活性较miR-NC组显著降低(P<0.01)。同与mut-circ_0011460共转染，miR-145组细胞相对荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图3 circ_0011460和miR-145互补序列及circ_0011460对miR-145表达的影响

表1 转染后miR-NC组与miR-145组HTR-8/SVneo细胞相对荧光素酶活性比较

2.4不同方法处理HTR-8/SVneo细胞活力及集落形成数比较 与si-NC组比较，si-circ_0011460组48、72 h的HTR-8/SVneo细胞活力、集落形成数显著增加(P<0.01)；与miR-NC组比较，miR-145组48、72 h的HTR-8/SVneo细胞活力、集落形成数显著增加(P<0.01)。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-145组48、72 h的HTR-8/SVneo细胞活力、集落形成数显著降低(P<0.01)；与si-circ_0011460组比较，si-circ_0011460+anti-miR-145组48、72 h的HTR-8/SVneo细胞活力、集落形成数显著降低(P<0.05)。见图4、5和表2。

表2 不同方法处理HTR-8/SVneo的细胞活性及集落形成数比较

图4 不同方法处理HTR-8/SVneo细胞增殖比较

2.5不同处理HTR-8/SVneo迁移能力比较 与si-NC组比较，si-circ_0011460组HTR-8/SVneo细胞侵袭数、划痕愈合率显著增加(P<0.01)；与miR-NC组比较，miR-145组HTR-8/SVneo细胞侵袭数、划痕愈合率显著增加(P<0.01)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-145组HTR-8/SVneo细胞侵袭数、划痕愈合率显著降低(P<0.01)；与si-circ_0011460组比较，si-circ_0011460+anti-miR-145组HTR-8/SVneo细胞侵袭数、划痕愈合率显著降低(P<0.01)。见图6、7和表3。

表3 不同处理HTR-8/SVneo细胞划痕愈合率和侵袭细胞数比较

图5 不同方法处理HTR-8/SVneo细胞集落形成情况

图6 不同处理HTR-8/SVneo细胞各时间点的划痕愈合率

2.6不同处理HTR-8/SVneo细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达量比较 与si-NC组比较，si-circ_0011460组HTR-8/SVneo细胞E-cadherin蛋白表达量显著降低，N-cadherin蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与miR-NC组比较，miR-145组HTR-8/SVneo细胞E-cadherin蛋白表达量显著降低，N-cadherin蛋白表达量显著增加，(P<0.01)。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-145组HTR-8/SVneo细胞E-cadherin蛋白表达量显著增加，N-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.05)。与si-circ_0011460组比较，si-circ_0011460+anti-miR-145组HTR-8/SVneo细胞E-cadherin蛋白表达量显著增加，N-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见图7和表4。

表4 不同处理HTR-8/SVneo中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达量比较

图7 不同处理HTR-8/SVneo中E-cadherin和N-cadherin蛋白免疫印迹图

图8 不同处理HTR-8/SVneo细胞侵袭细胞数的检测(SP×400)

3 讨论

PE作为临床常见的妊娠并发症，其影响全球3%～5%的孕妇，是胎儿发病和妊娠死亡的主要诱因，然而目前除早产或终止妊娠外，临床尚缺乏有效的PE治疗方法[5]。随着对circRNA、miRNA等非编码RNA作用的阐明，circRNA和miRNA在PE进展中的功能逐渐受到关注。Bai等[6]指出circ_0007021在PE和正常妊娠期间血浆中的表达存在差异，且这种差异可在妊娠20周之前检测到，circ_0007021可能是一种新的PE生物标志物。Zhang等[7]研究证实PE胎盘组织中circHIPK3表达降低，circHIPK3低表达明显抑制滋养细胞的迁移、侵袭、增殖和成管能力。Liu等[8]发现miR-34a通过Notch信号调控PE患者胎盘滋养细胞的侵袭。

本研究结果显示，circ_0011460在PE胎盘组织中表达增加，这与既往文献报道基本吻合[5]。本研究结果显示，PE胎盘组织中miR-145相对表达量减少，且circ_0011460和miR-145相对表达量呈负相关。本研究结果同时显示，miR-145是circ_0011460的靶基因，且circ_0011460对miR-145具有靶向负调控作用，提示circ_0011460可能靶向miR-145参与调控PE进展。

本研究结果显示，干扰circ_0011460可增加HTR-8/SVneo细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭能力；过表达miR-145亦可促进HTR-8/SVneo增殖、迁移和侵袭，这与Lv等[9]研究结论一致。然而，在胃癌等多种肿瘤细胞系中miR-145表达降低，上调miR-145通过靶向多种致癌基因可抑制肿瘤转移，具有抑癌作用[10-11]。此外，miR-145介导沉默circWHSC1对卵巢癌细胞恶性行为的抑制作用，这可能与miR-145的组织特异性表达模式有关[12]。本研究结果显示，抑制miR-145表达显著逆转干扰circ_0011460对HTR-8/SVneo增殖、迁移和侵袭的促进作用，这进一步证实circ_0011460靶向miR-145调控HTR-8/SVneo细胞生物学行为。然而，miR-145的下游靶点仍需进一步确认。

上皮间充质转化(EMT)是上皮细胞获得迁移和侵袭能力并转化间质细胞的过程，在妊娠期间滋养细胞通过EMT获得迁移、侵袭能力并侵入子宫内膜以重塑螺旋动脉，而滋养细胞的迁移和侵袭不足导致胎盘功能障碍[13]。E-cadherin和N-cadherin分别是上皮表型和间质表型标志蛋白，研究指出PE胎盘组织中E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低，去甲基化酶Alk B同源蛋白5(ALKBH5)、circ_0007121通过调节E-cadherin和N-cadherin蛋白表达可改变PE滋养细胞迁移和侵袭表型[14]。本研究结果显示，干扰circ_0011460或过表达miR-145均可下调E-cadherin蛋白表达量，上调N-cadherin蛋白表达量，这提示干扰circ_0011460或过表达miR-145可能通过诱导上皮-间质转化发挥促迁移、促侵袭作用。此外，抑制miR-145表达明显减弱干扰circ_0011460对HTR-8/SVneo细胞中N-cadherin、E-cadherin蛋白表达量的影响，这进一步证实circ_0011460靶向miR-145调控HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭。

综上所述，干扰circ_0011460通过靶向上调miR-145可促进PE滋养细胞增殖、迁移和侵袭，这为进一步了解PE发病机制提供了新的见解，为临床治疗PE提供了新的思路。