甲醇蛋白联产木聚糖酶发酵培养基优化

苟万晓，范延超，胡元森，任晓辉

1.义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南 义马 472300;2.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

甲醇蛋白是一类以甲醇和无机盐为主要原料，经液态通风发酵生产的单细胞蛋白[1].甲醇蛋白营养价值高，在食品、饲料等行业都有着广阔的应用前景[2-5]，联产酶制剂是甲醇蛋白的重要应用方向之一[6].将表达酶分子的目的基因通过基因工程手段构建生产甲醇蛋白的工程菌，经微生物发酵，可在生产甲醇蛋白的同时联产木聚糖酶.从发酵液中分离酵母菌体和上清液，将酵母菌体喷雾干燥后可制得单细胞蛋白，而上清液经一系列工艺提取后可制得酶制剂[7].

甲醇蛋白联产酶制剂的生产工艺水平决定了酶制剂最终产品中有效成分的含量、卫生程度、产品品质及产品稳定性.而发酵培养基的配方决定了生产工艺水平的高低，进而影响酶制剂最终产品的生产成本、生产效率，以及生产过程中的环境保护、应用范围等[8].毕荣宇等[9]分别以玉米粉和豆粕为碳源和氮源生产单细胞蛋白，通过单因素试验和正交试验对发酵培养基进行优化，可有效提高单细胞蛋白的产量.H.L.Wang等[10]采用提高外源蛋白产量的连续培养策略，显著提高了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的活性及细胞活力.杜少平等[11]比较了不同碳源、不同氮源对重组毕赤酵母发酵产β-甘露聚糖酶的影响，并在50 L发酵罐中采用间歇流加策略对发酵条件进行调控，实现了重组毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶.魏涛等[12]构建了重组毕赤酵母工程菌，分析了金属离子对果糖基转移酶AoFT酶活性的影响.李昆太等[13]以甜高粱秸秆汁为基础发酵原料，优化生产单细胞蛋白的发酵培养基，相较原发酵培养基，热带假丝酵母SG-1的单细胞蛋白产量提高了42.8%.因此，对发酵培养基的组成及配比进行优化，对酶制剂产业的发展有重要的价值[14-15].在前期工作中，笔者以毕赤酵母为出发菌株对甲醇蛋白生产工艺条件进行优化，有效提高了甲醇蛋白的产量[16].基于此，本研究拟在100 L发酵罐中，对影响甲醇蛋白联产木聚糖酶的培养基组分及其质量浓度等因素进行优化，以获得最优发酵培养基，为高效生产木聚糖酶及甲醇蛋白联产木聚糖酶的开发应用提供数据支撑.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株巴斯德毕赤酵母原始菌株，保存于中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCC NO:MC2013519)，经课题组诱变选育，获得了优良菌株毕赤酵母菌hgd-xm-301(Pichiapastorishgd-xm-301).该菌株能够在利用常规工业甲醇生产甲醇蛋白的同时，高效表达木聚糖酶.该菌株于4 ℃条件下采用斜面培养基保存，供日常实验使用，于-196 ℃液氮中采用甘油管保存备用.

1.1.2 主要试剂酵母浸粉、蛋白胨，均为生化级，葡萄糖、H3PO4、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O等，均为分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司产；其他常规分析纯试剂，洛阳昊华化学试剂有限公司产.

1.2 主要仪器与设备

DGG-101-1型电热鼓风干燥箱、HP-9052型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产；ADVENTURER型电子天平，奥豪斯仪器有限公司产；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂产；HZQ-X100型振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产；T-6型可见-紫外分光光度计，北京新世纪电子技术开发有限公司产；BH-2 Olympus型显微镜，日本奥林巴斯公司产；100 L发酵罐，上海百伦生物科技有限公司产.

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养基及培养条件选择YEPD复合培养基为种子培养基：酵母浸粉1 g/L，蛋白胨2 g/L、葡萄糖2 g/L，KH2PO40.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，pH值为5.0.培养条件：在250 mL摇瓶中装入50 mL种子培养基，毕赤酵母接种量为1%，于30 ℃，200 r/min摇床培养24 h[17].

1.3.2100L发酵罐发酵培养基及培养条件选择毕赤酵母常用的基础发酵培养基BSM为100 L发酵罐发酵培养基，分别以H3PO4、K2HPO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O的质量浓度作为单因素，研究培养基不同组分对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响，并进行正交试验.培养条件：定容60 L，毕赤酵母接种量为1%，培养温度30 ℃，pH值4.5～5.0，空气流量4～8 m3/h.

1.3.3 菌体湿重的测定以100 L发酵罐发酵培养基进行5组平行发酵实验，以BSM培养基为对照.发酵过程中每隔8 h取样检测菌体湿重，当湿重不再增长或略微下降时结束发酵，并记录最终菌体湿重.菌体湿重的测定方法为：首先将离心管干燥并称重，取50 mL菌悬液置于该离心管内，于4500 r/min条件下离心10 min，弃上清液，固形物(菌体)用去离子水洗涤、离心2次后，称重[17].

1.3.4 木聚糖酶活力的测定采用GB/T 23874—2009[18]方法测定发酵液木聚糖酶活力.以100 L罐发酵培养基进行5组平行发酵实验，以BSM培养基为对照.发酵过程中每隔8 h取样检测木聚糖酶活力，当酶活力不再增加或略微下降时结束发酵，并记录最终酶活力结果.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1H3PO4质量浓度不同H3PO4质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图1所示.由图1可以看出，随着H3PO4质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当H3PO4质量浓度为25 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为358 g/L、33 800 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是因为随着培养基中H3PO4质量浓度的增加，培养基的酸度逐渐提高，pH值逐渐降低，而培养基的pH值对微生物的生长代谢有显著的影响，适宜的pH值有利于微生物的生长代谢，过低的pH值则将抑制微生物的生长代谢[19].因此，培养基中H3PO4的最适质量浓度为25 g/L.

图1 不同H3PO4质量浓度对菌体湿重 和木聚糖酶活力的影响Fig.1 Effect of different phosphoric acid concentrations on the wet cell weight and enzyme activity

图2 不同K2HPO4质量浓度对菌体湿重 和木聚糖酶活力的影响Fig.2 Effect of different concentrations of dipotassium hydrogen phosphate on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.3NH4Cl质量浓度不同NH4Cl质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图3所示.由图3可以看出，随着培养基中NH4Cl质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当NH4Cl质量浓度为0.30 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为369 g/L、35 000 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是因为NH4Cl作为无机氮源能够为毕赤酵母的生长提供氮元素.然而，氮源不足或者过量均不利于微生物的正常生长和代谢，因此还需优化培养基中氮源与碳源的比例, 从而提高微生物发酵产物的产量和品质[22].因此，培养基中NH4Cl的最适质量浓度为0.30 g/L.

图3 不同NH4Cl质量浓度对菌体湿重 和木聚糖酶活力的影响Fig.3 Effect of different ammonium chloride concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.4CaSO4·2H2O质量浓度不同CaSO4·2H2O质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图4所示.由图4可以看出，随着CaSO4·2H2O质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当CaSO4·2H2O质量浓度为0.20 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为373 g/L、35 650 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是因为培养基中添加适量的Ca2+对培养基的产酶能力具有较大的促进作用.研究表明[20-21]，添加一定质量浓度的CaSO4·2H2O能够在一定范围内促进酶活力的提升;但CaSO4·2H2O质量浓度过大会改变培养基的pH值，不利于毕赤酵母的生长和繁殖.因此，培养基中CaSO4·2H2O的最适质量浓度为0.20 g/L.

图4 不同CaSO4·2H2O质量浓度对菌体 湿重和木聚糖酶活力的影响Fig.4 Effect of different concentrations of calcium sulfate dihydrate on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.5NaCl质量浓度不同NaCl质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图5所示.由图5可以看出，随着NaCl质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当NaCl质量浓度为0.5 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为380 g/L、36 050 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是因为培养基中的Na+与维持细胞渗透压有关，一定质量浓度的NaCl可以改善培养基的渗透压，有利于菌体的生长；但当NaCl质量浓度过高时，培养基渗透压过大，会导致毕赤酵母细胞内外渗透压失衡，不利于其生长代谢.因此，培养基中NaCl的最适质量浓度为0.5 g/L.

图5 不同NaCl质量浓度对菌体湿重 和木聚糖酶活力的影响Fig.5 Effect of different sodium chloride concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.6K2SO4质量浓度不同K2SO4质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图6所示.由图6可以看出，随着K2SO4质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当K2SO4质量浓度为3.0 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为383 g/L、36 900 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是由于K2SO4能够提供丰富的K+，维持细胞渗透压平衡，在培养基中添加适量K2SO4对毕赤酵母的产酶能力具有较大促进作用;但当培养基中K2SO4质量浓度过大时，细胞的渗透压增大，不利于毕赤酵母的生长繁殖[20-21].因此，培养基中K2SO4的最适质量浓度为3.0 g/L.

图6 不同K2SO4质量浓度对菌体 湿重和木聚糖酶活力的影响Fig.6 Effect of different potassium sulfate concentration on the wet cell weight and enzyme activity

2.1.7MgSO4·7H2O质量浓度不同MgSO4·7H2O质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响如图7所示.由图7可以看出，随着MgSO4·7H2O质量浓度的增加，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均呈先上升后下降的趋势，当MgSO4·7H2O质量浓度为2.0 g/L时，发酵液的最终菌体湿重和木聚糖酶活力均达到最大值(分别为390 g/L、37 700 U/mL)，即此时甲醇蛋白和酶制剂的综合产量最大.这可能是由于Mg2+对培养基的产酶能力具有一定的激活作用，添加一定质量浓度的MgSO4·7H2O能够在一定程度上促进木聚糖酶活力的提升；但是，当MgSO4·7H2O质量浓度过大时，也会改变培养基的pH值，不利于毕赤酵母的生长繁殖[20-21].因此，培养基中MgSO4·7H2O的最适质量浓度为2.0 g/L.

图7 不同MgSO4·7H2O质量浓度对菌体 湿重和木聚糖酶活力的影响Fig.7 Effect of different concentrations of magnesium sulfate heptahydrate on the wet cell weight and enzyme activity

2.2 正交试验结果分析

根据上述单因素对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响，初步确定培养基配方为：H3PO4质量浓度25 g/L、K2HPO4质量浓度0.5 g/L、NH4Cl质量浓度0.30 g/L、CaSO4·2H2O质量浓度0.20 g/L、NaCl质量浓度0.5 g/L、K2SO4质量浓度3.0 g/L、MgSO4·7H2O质量浓度2.0 g/L.在此基础上，进行七因素三水平L18(37)正交试验，正交试验因素与水平见表1，正交试验方案及结果见表2.

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels Table g/L

由表2可知，菌体湿重和木聚糖酶活力两个指标的正交分析结果相同，即不同因素对两个指标的影响程度相同.综合分析，7个因素中极差越大,说明该因素对发酵水平影响越大.因此，按照各个因素对发酵水平的影响从大到小依次排序为C>F>A>B>D>G>E，即影响最大的为NH4Cl质量浓度，其他依次为K2SO4、H3PO4、K2HPO4、CaSO4·2H2O、MgSO4·7H2O和NaCl的质量浓度.各个因素中k值最大的水平即为最佳水平值，因此，最优方案为A2B2C2D3E3F2G3，即最优培养基配方为H3PO4质量浓度25 g/L、K2HPO4质量浓度0.5 g/L、NH4Cl质量浓度0.30 g/L、CaSO4·2H2O质量浓度0.25 g/L、NaCl质量浓度0.6 g/L、K2SO4质量浓度3.0 g/L、MgSO4·7H2O质量浓度2.2 g/L.

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal test plan and results

2.3 验证实验结果分析

按最优培养基配方进行100 L发酵罐验证实验，通过6次重复验证实验，菌体湿重和木聚糖酶活力结果见表3.由表3可知，在最优培养基配方下，菌体湿重和木聚糖酶活力均达到较高水平，其中菌体湿重达到409～417 g/L，木聚糖酶活力达到40 915～41 428 U/mL.

表3 最优培养基配方重复验证实验结果Table 3 Results of repeated validation test of optimal medium formula

3 结论

本文采用100 L发酵罐，研究了甲醇蛋白联产木聚糖酶培养基的组分及其质量浓度对菌体湿重和木聚糖酶活力的影响，通过单因素试验和正交试验得出最优培养基配方为H3PO4质量浓度25 g/L、K2HPO4质量浓度0.5 g/L、NH4Cl质量浓度0.30 g/L、CaSO4·2H2O质量浓度0.25 g/L、NaCl质量浓度0.6 g/L、K2SO4质量浓度3.0 g/L、MgSO4·7H2O质量浓度2.2 g/L.进一步验证实验结果表明，在最优培养基配方下，菌体湿重达到409～417 g/L，木聚糖酶活力达到40 915～41 428 U/mL.本研究可为实验室诱变选育高产甲醇蛋白毕赤酵母菌高效表达木聚糖酶，为实现甲醇蛋白联产木聚糖酶奠定重要基础.