Box-Behnken响应面法优化制远志与蜜远志的炮制工艺

袁蒙蒙，阴美华，唐志书，许洪波*，陈世忠（.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 72046；2.北京大学药学院，北京 009）

远志为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.或卵叶远志Palygala sibiricaL.的干燥根。气微，味苦，微辛，具有安神益智、祛痰、消肿解毒的功效，临床用于治疗心肾不交引起的失眠多梦、咳痰不爽、疮疡肿毒等。远志中含有多种皂苷、酮及糖酯类成分，如细叶远志皂苷A，远志酮Ⅲ和3，6'-二芥子酰基蔗糖等[1]。其中皂苷类成分可刺激胃黏膜，反射性地增加支气管的分泌而发挥祛痰作用，但同时会导致轻度恶心[2-3]。

远志最早记载于汉代的《神农本草经》，在中医药治疗中应用较为广泛，其临床主要使用生远志、制远志、蜜远志等，不同炮制方法对于中药远志的有效成分含量和疗效存在差异[4]。在《雷公炮炙论》中记载远志可用甘草炮制，“凡使远志，先须去心，若不去心，服之令人闷。去心了，用熟甘草汤浸一宿，漉出，曝干用之”。有研究表明远志经蜜炙后，其所含有的细叶远志皂苷减少，提示远志炮制解毒的机制可能是通过降低皂苷含量来实现的[5]。本研究利用单因素和响应面法优化制远志和蜜远志的炮制工艺，同时建立了HPLC 法测定不同炮制法远志中7 种有效成分的含量，为远志的临床应用和工业生产提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津UPLC 液相色谱仪（LC-20ADXR 高压泵、CTO-20AC 柱温箱、SPD-M20A 二极管阵列检测器、SIL-20AC 自动进样器、CBM-20A 控制器、DGU-20A5R自动脱气机、LC Solution 工作站）；电子天平（ME204，瑞士Mettler-Toledo 公司）；101 型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；多功能粉碎机（TQ-500，上海天祺盛世科技有限公司）；水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 试药

生远志（宝鸡市博仁药业有限公司），由北京大学医学部陈世忠教授鉴定为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根。7 种对照品信息见表1。乙腈（色谱纯，Merck 公司），甲酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），超纯水（Milli-Q 制备），甲醇（色谱纯，Merck 公司）。

表1 对照品信息Tab 1 Reference material information

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 HPLC 色谱条件[6-9]色谱柱：Hypersil GOLDTM C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；按照表2 进行梯度洗脱；检测波长为310 nm；进样量为3 µL；柱温30℃；流速为0.4 mL·min－1。按照上述色谱条件测定饮片中7 种对照品的含量，分别测定对照品和样品，记录色谱图。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入85%甲醇15 mL，称定重量，80 ℃条件下加热回流70 min，放冷，再称定重量，用85%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下的单一对照品储备液，以甲醇倍比稀释5 次，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，绘制各标准曲线，得到线性回归方程和线性范围，结果见表3，色谱图见图1。

表3 7 种指标成分的回归方程及线性范围Tab 3 Regression equation and linearity of 7 index components

图1 远志样品（A）和混合对照品（B）HPLC 图Fig 1 High performance liquid chromatography of Polygala tenuifolia（A）and mixed reference substance（B）

2.1.5 精密度试验 取对照品溶液，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，结果远志酮B、远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷A、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷FRSD分别为1.1%、0.26%、0.49%、0.58%、0.90%、0.25%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一批远志药材粉末，按照“2.1.3”项下制备供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12 h，进样测定，结果远志酮B、远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷A、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷FRSD分别为2.1%、0.66%、1.0%、2.4%、1.1%、0.66%、1.1%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批远志药材粉末6 份，精密称定，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果远志酮B、远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷A、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷FRSD分别为1.3%、0.90%、0.81%、2.7%、2.6%、0.99%、1.2%，表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 精密称取9 份已知含量的远志饮片粉末（过三号筛）0.5 g，每3 份分别按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2 精密加入远志酮B、远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷A、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷F 对照品，按“2.1.3”项下方法制备，进样测定，计算7种成分的平均加样回收率和RSD值，远志酮B为96.22%（RSD＝1.9%）、远志糖苷C 为94.58%（RSD＝2.0%）、细叶远志皂苷A 为102.34%（RSD＝1.0%）、远志酮Ⅲ为96.63%（RSD＝0.97%）、3，6'-二芥子酰基蔗糖为98.75%（RSD＝2.3%）、远志皂苷B 为98.81%（RSD＝1.3%）、远志皂苷F 为103.85%（RSD＝2.6%）。

2.2 评价方法

采用加权平均法，根据7 种对照品成分的药理作用情况，确定远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖的含量均占权重的25%，细叶远志皂苷A、远志酮B、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷F的含量均占权重的10%[10]。本试验以综合评分OD值（Y）为评价指标，Y＝（A/Amax）×25%＋（B/Bmax）×25%＋（C/Cmax）×10%＋（D/Dmax）×10%＋（E/Emax）×10%＋（F/Fmax）×10%＋（G/Gmax）×10%，Amax～Gmax分别为各成分对应的最高含量。

2.2.1 制远志单因素炮制工艺考察 分别考察辅料甘草汁用量（4%、5%、6%、7%、8%），加水倍数（25、30、35、40、45 倍）及煎煮时间（25、30、35、40、45 min）对远志炮制的影响。称取甘草，纯净水浸泡，煎煮两次，合并甘草水煎液，加入远志采用文火煮至甘草汁吸尽[11-12]。取出冷却，干燥，即得制远志饮片。计算综合评分，结果见图2。炮制辅料用量为5%、加水倍数35 倍、煎煮时间为40 min 时，综合评分最高，因此，将其选择作为响应面试验中炮制辅料用量的中心点。

图2 辅料用量（A）、加水倍数（B）和煎煮时间（C）对制远志综合评分的影响Fig 2 Influence of the amount of excipients（A），water addition（B）and decoction time（C）on the comprehensive score of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

2.2.2 蜜远志单因素炮制工艺考察 考察炮制辅料蜜炼的用量（15%、20%、25%、30%、35%），炮制温度（100、120、140、160、180℃）、炮制时间（3、8、13、18、23 min）对蜜远志炮制工艺的影响。称远志样品200 g，分别焖润2 h，用文火炒至炼蜜被吸尽，远志表面为深黄色且不黏手，取出冷却，干燥，即得蜜远志饮片[13-14]。同法计算综合评分，结果见图3。炮制辅料用量为25%、炮制温度为140℃、烘制时间为8 min 时，综合评分最高，因此，将其作为响应面试验中炮制辅料用量的中心点。

图3 辅料用量（D）、温度（E）和炮制时间（F）对蜜远志综合评分的影响Fig 3 Influence of the amount of excipients（D），temperature（E）and processing time（F）on the comprehensive score of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.3 制远志及蜜远志响应面法优化炮制工艺

2.3.1 试验设计 在单因素试验结果的基础上，根据中心组合试验设计原理，利用Design-Expert 8.0.6 软件，设计3 因素3 水平的响应面试验。选取甘草用量（A）、加水倍数（B）和煎煮时间（C）为自变量，以远志酮B、远志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷A、远志糖苷C、远志皂苷B、远志皂苷F 的综合评分（Y1）为响应值，考察制远志的炮制工艺；同时，在单因素试验结果的基础上，选用炼蜜用量（D）、炮制时间（E）、炮制温度（F）作为考察因素，综合评分（Y2）为响应值，考察蜜远志的炮制工艺。利用Design-Expert 8.0.6 软件设计3 因素3 水平试验，因素与水平见表4。试验安排与结果见表5。

表4 制远志及蜜远志响应面试验因素与水平Tab 4 Factor and level of response surface test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

表5 制远志及蜜远志响应面试验设计及结果Tab 5 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia response surface test arrangement and results

2.3.2 回归模型的建立及分析 对试验结果进行拟合回归分析，得到Y1＝80.31＋5.71A＋1.61B＋0.11C＋3.90A2＋1.66B2＋0.21C2－1.10AB＋0.36AC＋0.26BC；Y2＝84.86－3.64A＋0.030B－2.44C－3.47A2－3.16B2－2.19C2＋5.64AB－1.73AC－0.040BC。该模型P＜0.001，具有极显著性并且与数据的拟合度好，误差低，可以用于进一步的分析与检测[15-16]，结果见表6。

表6 制远志和蜜远志回归模型方差分析Tab 6 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia regression model variance analysis

2.3.3 响应面图的分析与优化 根据制远志回归方程可绘制出响应曲面，见图4。由图4可知，在响应面试验中时间的梯度设计较小，对制远志的综合评分影响较小。甘草用量与加水量的交互作用对Y1的影响较大，所以图中显示曲面较为陡峭；加水量越大制远志提取液中有效成分的含量更高，但从节约能源和生产耗能方面考虑，加水量应根据试验调整。甘草用量为5.96%，加水量为36.21 倍，时间设定为40.43 min 时为制远志的最佳炮制工艺。

图4 不同炮制参数对制远志综合评分Y1 的响应面图Fig 4 Response surface plot of different processing parameters to the comprehensive score Y1 of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

根据蜜远志回归方程可绘制响应曲面，见图5。由图5可知，在炼蜜用量与温度交互作用时曲面较为陡峭，分析原因可能是由于温度会使炼蜜性质发生变化，从而影响蜜远志的成分的含量，所以对蜜远志的综合评分Y2影响较大。在炼蜜用量为25%，温度为122.27 ℃，时间设定为7.22 min 时可以得到蜜远志的最佳炮制工艺。

图5 不同炮制参数对蜜远志综合评分Y2 的响应面图Fig 5 Response surface diagram of different processing parameters to the comprehensive score Y2 of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.6 验证试验

以远志为原料，根据响应面预测值和实际操作调整制远志的炮制工艺为甘草用量6%，加水36倍，炮制时间为40 min；蜜远志的炮制工艺为炼蜜用量25%，温度123℃，炮制时间为7 min。按上述最优制备工艺进行验证，平行操作6 次，测定7 种成分的含量，结果见表7。所得制远志综合评分（90.08%）与预测值89.69%相近，蜜远志综合评分（85.45%）与预测值87.58%相近，这说明该工艺条件稳定可行，模型拟合效果良好[17]。

表7 制远志和蜜远志的验证试验结果(%)Tab 7 Verification test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia (%)

3 讨论

本研究利用单因素和响应面试验优化了制远志和蜜远志的炮制工艺，筛选甘草的用量、加水倍量和煎煮时间以及炼蜜用量、温度和炮制时间对远志炮制工艺过程具有显著性影响的因素，对试验数据建立二次多项式回归模型，明确了最优工艺。

在中药的炮制过程中辅料的用量和炮制时参数的设定对与中药有效成分含量有较大影响，由试验结果知，制远志含量的综合评分较蜜远志高，蜜炙后所含远志皂苷减少，减毒效果更好。甘草制远志时甘草用量和加水量的变化对综合评分影响较大；炼蜜炮制远志时炼蜜的用量和炮制温度对蜜远志的质量影响较大，在试验和生产中需要对其参数进行量化考察，依据文献报道和响应面试验因素之间的交互作用结果得到最佳工艺参数，制远志的最佳炮制工艺为甘草用量6%，加水36 倍，炮制时间为40 min；蜜远志的最佳炮制工艺为炼蜜用量25%，温度123℃，炮制时间为7 min。通过试验设计和验证能够在一定程度上控制炮制远志的质量，提高工艺的稳定性，为中药远志的炮制工艺优化提供参考。