QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定3种β-受体激动剂

◎ 潘 璐，罗诗泳

（1.佛山市南海区里水镇农林服务中心，广东 佛山 528000；2.佛山市沃特测试技术服务有限公司，广东 佛山 528000）

β-型受体激动剂，又称瘦肉精，是我国动物食品中禁止使用的药品[1]，其中β2-受体激动剂属于苯乙胺类药物，苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链，能与无机酸或有机酸反应生成盐。按照苯环上的取代基的差异，可将β2-受体激动剂分为苯胺型和苯酚型。苯胺型为中等极性；苯酚型细分为邻苯二酚型、间苯二酚型和水杨醇型，有较高极性[2]。本文测定的瘦肉精为克伦特罗（苯胺型）、沙丁胺醇（水杨醇型）和莱克多巴胺（间苯二酚型）。

目前的国家标准和行业标准检测瘦肉精时，动物肌肉组织前处理采用酶水解，正己烷除脂，后用MCX固相萃取柱净化[3]；或是酶水解与酸水解结合使用，后用HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱净化[4-5]。这些方法的处理时间长、步骤烦琐技术要求高，耗材成本也高。QuEChERS净化法简化了净化的流程，操作简便，但目前国家标准只有在测动物血液和尿液中的瘦肉精残留量时使用[6]。本文采用酸化乙腈QuEChERS净化与反萃前处理样品，液相串联质谱测定，对克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺3种瘦肉精残留量进行了方法验证，探索了在动物肌肉组织中使用酶水解-QuEChERS净化法测定瘦肉精的可能性。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源（美国ABSciex公司4500型）；氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；高速冷冻离心机（Sigma-Aldrich中国）；电子分析天平（分度值0.01）；食物搅拌机（艾美特电器有限公司）；旋涡混匀器（德国IKA公司）；尼龙针式过滤器（0.22 μm）。

1.2 标准物质与试剂

克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇混合溶液标准物质，浓度均为100 μg·mL-1于甲醇，中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（农业部农产品质量标准研究中心）提供。

乙腈（色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，上海阿拉丁公司），乙酸铵（分析纯，上海阿拉丁公司），Bond Elut EMR-Lipid增强型脂质去除净化管（美国安捷伦公司，货号5982-1010），Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管（美国安捷伦公司，货号5982-0101），水（一级水，Milli-Q制备）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

瘦肉精混合标准系列工作液。分别准确量取适量的瘦肉精混合标准溶液，用50%乙腈溶液逐级稀释，配制成浓度分别1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1，现配现用[7]。

1.3.2 试剂配制

5%酸化乙腈溶液：将5 mL甲酸加入95 mL乙腈中制得，现配现用；1 mol·L-1乙酸铵储备液：将19.27 g乙酸铵溶解于250 mL水中，保存在4 ℃冰箱；5 mmol·L-1乙酸铵缓冲液：将5 mL的1 mol·L-1乙酸铵储备液加入1 L水中，现配现用；50%乙腈溶液：准确移取10 mL乙腈，用水定容至20 mL；流动相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液，将2 mL甲酸和2 mL的1 mol·L-1乙酸铵溶液用水定容至1 L，现配现用；流动相B：0.2%甲酸甲醇，取2 mL甲酸，用甲醇定容至1 L。

1.3.3 样品前处理

取500 g猪肉样品，去除筋膜，切小块，用食物搅拌机打至匀浆。

称取2 g（精确到0.1 g）猪肉匀浆后样品，加入10 mL酸化乙腈和陶瓷均质子，涡旋振荡2 min；以5 000 r·min-1、4 ℃离 心5 min；在Bond Elut EMRLipid增强型脂质去除净化管中加入5 mL乙酸铵缓冲液和5.0 mL上清液，迅速涡旋震荡1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃离心5 min；取5 mL乙腈上清液加入到Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管中，迅速涡旋振荡1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃离心5 min；准确吸取离心后的上清液0.2 mL用水定容至1 mL，混合后过0.22 μm尼龙针式过滤器后上机[7-9]。

1.3.4 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃，进样量：2 μL，流速为0.4 mL·min-1；流动相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液；流动相B，0.2%甲酸甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，95%流动相A，5%流动相B；3.0 min，85%流动相A，15%流动相B；10.0 min，60%流动相A，40%流动相B；18.0～22.0 min，100%流动相B；22.1～26.0 min，95%流动相A，5%流动相B。

离子源：电喷雾离子源（ESI）；电离源极性：正模式；扫描模式：MRM；干燥器温度：250 ℃；干燥器流速：7 L·min-1；雾化器压力：241.32 kPa；监测离子，监测离子见表1。

表1 3种瘦肉精监测参数表

2 结果与分析

2.1 结果计算

采用基质匹配标准曲线校准，外标法定量。被测瘦肉精残留量ω以其在试样中质量分数计，单位为μg·kg-1，按公式（1）计算。

式（1）中，ρ表示由基质匹配标准曲线查得试样中瘦肉精的质量浓度，μg·L-1；V1表示提取溶剂总体积，mL；V2表示用于上机检测的提取溶液的体积，mL；V3表示样品溶液上机定容体积，mL；m表示试样的质量，g。计算结果保留3位有效数字。

2.2 线性范围与检出限计算

将克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇混合标准品 配 置 成 浓 度 分 别 为1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1的工作溶液。以瘦肉精标准溶液中被测组分的峰面积为纵坐标（Y），标准工作溶液浓度（μg·L-1）为横坐标（x）绘制校准曲线。计算瘦肉精各组分回归曲线方程与相关系数，见表2。

根据要求，用信噪比法评估检出限（LOD），以产生3倍信噪比信号的检测浓度为检出限[8]。在阴性猪肉样品中加入一定量的瘦肉精混合标准工作液，按1.3的步骤处理与测试，根据公式（2）计算方法检出限。

式（2）中，DL表示方法检出限，μg·kg-1；N表示背景噪声峰高；C标表示试样中添加的瘦肉精混合标准工作液的浓度，μg·L-1；V2表示上机定容体积，mL；V3表示试样中提取溶剂总体积，mL；V1表示用于上机检测的提取溶液的体积，mL；H表示已添加瘦肉精混合标准工作液的试样峰高；M表示样品称样量，g。

2.3 准确度和精密度

准确度是指测得值与真值的符合程度，参照标准要求，本方法准确度用回收率表示，精密度用相对标准偏差（RSD）表示[4]。

取30个各2.0 g的阴性猪肉样品，参照国标的回收率添加质量浓度，分别添加1.00 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1共3个水平浓度添加标准溶液[4]，每个水平做10个平行[10]。样品按1.3.2前处理步骤后进行上机测试。分别计算各检测项目的平均值，平均回收率，相对标准偏差（RSD），计算结果见表3、表4、表5，加标图谱见图1。结果表明，克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的回收率在100.2%～110.4%，相对标准偏差在0.7%～3.1%（n=10），满足标准要求[11]。

表3 克伦特罗回收率和相对标准偏差测定结果表

表4 莱克多巴胺回收率和相对标准偏差测定结果表

表5 沙丁胺醇回收率和相对标准偏差测定结果表

图1 克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇添加量1.00 μg·kg-1时谱图

3 结论

本方法采用酸化乙腈提取QuEChERS净化与反萃前处理样品，液相串联质谱测定，对克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺3种瘦肉精残留量进行测定方法验证。结果表明，此方法的校准曲线、相关系数、检出限、精密度、准确度均满足的要求。