高效液相色谱-串联质谱法测定马铃薯中的α-茄碱和α-卡茄碱

◎ 陈琳珊，陈佩佩，陈 茹，吴永坤

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省质量监督食品检验站，广东 广州 511442；4.中山市小榄镇农产品质量检验检测中心，广东 中山 528400）

茄碱是一种有害的生物碱类物质，主要以糖苷的形式存在，一般出现在茄科类作物中，尤其是腐败的茄科蔬菜[1]，是导致茄科蔬菜中毒中的常见毒素之一。其主要成分为α-茄碱和α-卡茄碱，结构式见图1。茄碱抑制体内胆碱酯酶的活性，从而使乙酰胆碱积聚，引起神经兴奋，胃肠肌肉痉挛，中毒时出现腹痛、腹泻、恶心和呕吐等症状，情况严重时可导致脱水、发热、昏迷，甚至呼吸衰竭[2-3]。尽管有研究表明，茄碱对前列腺、肝、乳腺等癌细胞有一定的抑制作用[4-6]，但对消费者日常饮食的危害也不容忽视。

图1 α-茄碱和α-卡茄碱的化学结构式图

目前，针对茄碱的分析方法主要分为化学方法、成像技术和生物技术3大类[7]，由于分光光度法[8]、成像技术[9]、放射免疫[10]、酶联免疫[11]和比色法[12]等方法存在定量不准确、操作烦琐、耗时长和价格昂贵等缺点，科研工作者的研究主要集中在高效液相色谱法[13]和液相色谱-串联质谱法[14]。但高效液相色谱法需调节流动相使目标物有效分离，因此分析时间长，且α-茄碱和α-卡茄碱吸光度较弱，因此检测波长较低，容易受杂质干扰，影响分析结果。质谱法具有定性定量能力强、分析时间短、灵敏度高等优点，适合常规实验室的批量化检测。本文建立的高效液相色谱-串联质谱法，经方法学验证，具有较高灵敏度，同时回收率高，重现性好，可为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

API4000Q TRAP质谱仪（美国AB SCIEX公司）、岛津LC-20AD液相色谱系统（日本岛津公司）、4k-15离心机（北京卓明贸易有限公司）、IKA Vortex4涡旋混匀器（广州仪科实验室技术有限公司）、Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（法国Merck Millipore公司）。

α-茄碱、α-卡茄碱（纯度大于98.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司，购自上海安谱公司）、甲酸、甲醇、乙腈（LC-MS级，美国Thermo Fisher公司）、C18、PSA、GCB、硅胶、NH2粉、中性氧化铝、碱性氧化铝（分析纯，购自上海安谱公司）。

1.2 标准溶液的配制

标准溶液：分别称取两种茄碱适量标准品，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg·mL-1的标准溶液，于4 ℃下避光保存。

混合标准工作溶液：将标准溶液用乙腈稀释为10 mg·L-1的中间液，将马铃薯基质溶液依次稀释为10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1、1 000 μg·L-1制作校准曲线，标准加入法定量。

1.3 样品前处理

马铃薯样品均质。称取2.5 g样品于50 mL离心管中，加5 mL 水和20 mL 0.5%甲酸乙腈溶液（V/V），涡旋混匀，加4.0 g无水硫酸镁和1.5 g醋酸钠粉末，涡旋提取10 min。后置于离心机中，以10 000 r·min-1离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中，并定容混匀。取1 mL提取液用50 mg C18净化，过膜上机。

1.4 色谱条件

色谱柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；流动相A（乙腈）-B（0.1%甲酸水溶液）（V/V）；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脱程序：0.0～0.5 min：40%A，0.5～3.0 min：40%～90%A，3.0～3.5 min：90%A，3.5～4.0 min：90%～40%A，4.0～5.0 min：40%A。

1.5 质谱条件

离子源电离方式：正模式；气帘气压力：25 psi；电离电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；雾化气（GAS1）：50 psi；加热辅助气（GAS2）：50 psi；碰撞气（CAD）：medium；采集模式：多反应监测（MRM）模式。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

α-茄碱和α-卡茄碱均为糖苷，由于其主体结构上含有一个叔胺碱的N原子，在ESI源正负离子模式均有响应。经两种模式对相应的母离子扫描后发现，正离子模式下母离子[M+H]+比负离子模式下的[M-H]-的响应更强，可能是因为主体结构上的N原子或糖苷上的O原子获取H原子的能力比糖苷上羟基-OH失去H原子更容易发生。确定母离子后，通过调节碰撞电压（Collision Energy，CE）获得尽可能多的二级子离子，以多反应监测模式分别对去簇电压（Declustering Potential，DP）及子离子对应的碰撞电压进行优化，α-茄碱和α-卡茄碱的MS/MS参数见表1。

表1 多反应监测方法测定α-茄碱和α-卡茄碱的MS/MS参数表

2.2 色谱柱的选择

α-茄碱和α-卡茄碱结构十分相似，其差异仅为糖苷位置不同和糖苷上的羟基数量不同，在化学式上的差异也仅有一个O原子的质量数，因此其色谱行为也十分相似，在色谱中难以分离，尽管对于三重四极杆结构来说，可不作细致的色谱分离，但由于化学式相似，为避免α-茄碱在离子源内裂解出m/z852.9，影响定量结果，实验使用了安捷伦、Waters和菲罗门公司的3款色谱柱，对2种目标物进行分离。如图2所示，只有Waters公司的Xbridge BEH C18色谱柱有良好分离效果，原因可能是色谱柱的粒径大小对分离效果有较大影响，因此选择Xbridge BEH C18色谱柱。

2.3 固相萃取剂种类的选择

在实验初期发现，在乙腈中加入甲酸能提高回收率，但体积在20 mL以上时，回收率变化不大，因此在此基础上对固相萃取剂种类进行探究。使用量为50 mg时，结果显示C18的回收率最高，GCB和碱性氧化铝对目标物吸附严重，回收率极低。尽管PSA和硅胶能吸附糖类或其他大极性杂质，但回收率也低于50%，综合考虑，选择C18对提取液进行净化，详细结果见图3。

图3 固相萃取剂种类对回收率的影响图

2.4 基质效应

样品含有淀粉较多，若使用针对淀粉进行净化的固相萃取剂，对目标物也有严重吸附，因此可能存在一定的基质效应。为进一步考察，实验使用乙腈溶液配制浓度为100 μg·L-1的单点标准溶液，取2份马铃薯基质液，1份直接测定本底值，1份用于配制基质单点，浓度为100 μg·L-1。以乙腈溶液配制的单点计算，扣除本底值后，基质单点中α-茄碱和α-卡茄碱的浓度分别为43.5 μg·L-1和48.1 μg·L-1，说明基质效应抑制响应值比例为原来的45%，小于80%，需用基质曲线进行校正，由于没有找到空白的基质样品，因此校正浓度截距后定量。

2.5 定量方程及准确性

使用马铃薯基质液配制曲线后测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得到的曲线的X轴截距的绝对值为该样品含量，若要使用此曲线对其他马铃薯样品进行定量，需将X轴截距校正至原点。在1.2的线性范围内（10～1 000 μg·L-1），测定α-茄碱和α-卡茄碱的曲线方程分别为Y=88.5X+3 800和Y=157X+2 970，相关系数R2为0.999 6和0.999 4。按照信噪比的3倍和10倍不断稀释样品浓度后，方法检出限均为0.1 mg·kg-1，定量限均为0.3 mg·kg-1。线性范围、相关系数、检出限和定量限均满足一般样品中α-茄碱和α-卡茄碱含量的测定，达到准确定量。

2.6 方法学结果评价

按1.3对样品进行测定，选择含量最低的样品平均测定6次，取其平均含量作为本底值。按照本底值附近的1倍、2倍和5倍3个水平进行加标。每个水平测定6次，α-茄碱和α-卡茄碱的3个添加水平的平均回收率范围在85.7%～99.5%，相对标准偏差RSD在1.89%～3.31%。回收率及精密度均能达到定量要求，结果见表2。

表2 α-茄碱和α-卡茄碱的回收率和精密度表（n=6）

3 结论

建立HPLC-MS/MS法同时测定马铃薯中α-茄碱和α-卡茄碱，使用甲酸-乙腈萃取后，盐析离心，进一步使用C18固相萃取剂净化，回收率达85%以上；多反应监测模式对母离子和子离子进行扫描，优化了质谱参数，使方法整体检出限和定量限达到分析定量要求；使用不同色谱柱进行对比，在优化的色谱条件下，α-茄碱和α-卡茄碱2 min内完全分离，且分离度高；3水平加标回收实验的回收率和相对标准偏差结果表明，该方法可作为日常马铃薯品质监控的有效手段。