MMP-2在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用

孙静 盛天强 姚鹏 孙文华 詹芬芳 陈勇 胡衍辉 余树春 徐国海

(1南昌大学第二附属医院麻醉与围术期医学科 江西省麻醉学重点实验室，江西 南昌 330006；2南昌大学医学院；3湖北省孝感市中心医院；4江西省高安市妇幼保健院)

缺血缺氧性脑血管疾病迄今尚未发现有效的治疗方法。研究表明，炎性机制是脑缺血再灌注损伤的最重要机制之一，脑缺血损伤诱导炎性细胞激活和大量炎性细胞因子释放在脑缺血损伤过程中有重要作用〔1，2〕。基质金属蛋白酶(MMP)-2在炎性反应过程中发挥重要作用，研究表明，MMP-2在心肌缺血再灌注损伤发生后表达明显升高，而通过使用MMP-2抑制剂(TIMP-2)可有效缓解缺血再灌注损伤诱导的心功能恶化〔3，4〕，但MMP-2参与缺血性脑血管病的确切机制尚不清楚。本研究探讨MMP-2在脑缺血缺氧炎性反应中的作用及调控机制。

1 材料与方法

1.1动物选择及分组 健康雄性SD大鼠(购于南昌大学实验动物科学部)48只，4～6周龄，体重200～220 g。采用随机数字表法分为假手术组(Sham组)、局灶性脑缺血/再灌注损伤模型组(IR组)、TIMP-2组(T组)。IR组和T组采用线栓法进行大鼠脑缺血2 h再灌注制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，T组于模型制备前给予TIMP-2，Sham组仅分离、结扎右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，不置入线栓。

1.2模型建立 参照文献〔5〕方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。腹腔注射10%水合氯醛(2 mg/kg)进行麻醉，将大鼠仰卧位固定于动物手术台上。碘伏消毒颈部皮肤并铺无菌洞巾，取正中切口切开皮肤筋膜，钝性分离肌肉至颈动脉鞘，结扎右侧颈总动脉及颈外动脉。随后在颈总动脉分叉处用眼科剪剪开小口，将线栓(直径 0.26 mm，长5 cm)置入右侧颈内动脉约2 cm，生理盐水冲洗后逐层缝合，2 h后提拉线栓至颈总动脉内。术中用烤灯照射维持大鼠体温(36±1)℃，术后肌注青霉素10万U/只。

1.3神经功能缺失体征(NDS)评分 参照Longa等〔6〕评分标准：无神经功能缺失症状，活动正常者，计0分；不能完全伸展对侧前爪，计1分；动物爬行时出现向左转圈追尾现象，计2分；身体向偏瘫侧倾倒者，计3分；不能自发行走，意识丧失者，计4分。

1.4血脑屏障通透性检测 使用伊文思蓝(EB)注射法评价血脑屏障通透性。使用10%水合氯醛麻醉大鼠。随后经股静脉注入2% EB溶液，2 h后打开胸腔，通过升主动脉灌注生理盐水200 ml，断头取脑，用冰生理盐水冲洗。擦干后称重，加入2 ml 50%三氯乙酸溶液匀浆，4℃ 1 000 r/min离心15 min，取上清液，加入等体积无水乙醇。使用分光光度计检测620 nm处吸光度OD值，并计算脑组织中EB含量。

1.5MMP-2蛋白表达的测定 采用Western印迹法进行检测。取大鼠脑组织，液氮研磨后提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，标记后-20℃保存。各取蛋白样品上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80 V恒压电泳至指示带分离，随后250 mA恒流转移120 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入MMP-2一抗(稀释度1∶1 000，Abcam公司，美国)、β-actin一抗(稀释度1∶1 000，北京全式金生物技术有限公司)4℃孵育过夜。次日TBST缓冲液漂洗后孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释度1∶6 000，北京全式金生物技术有限公司)，电化学发光(ECL)试剂显影，Image Lab 拍照分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白相对表达水平。

1.6荧光定量PCR检测MMP-2基因mRNA表达水平 取大鼠脑组织，液氮研磨后制备脑组织匀浆，Trizol法提取脑组织总RNA，测定RNA浓度及纯度，-80℃保存。从GenBank数据库查找MMP-2、β-actin引物序列(由华大基因合成)如下：MMP-2：上游引物5′-CTCTTCCATCCAACATGGATAGCTG-3′，下游引物5′-ACTCCAACTGTGAAGATCCGCTGA-3′。β-actin：上游引物5′-ATATCGCTGCGCTGGTC-3′，下游引物5′-ACCCATTCCCACCATCACAC-3′。反应条件：42℃孵育15 min，85℃加热5 s；94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，循环40次。以β-actin为内参，使用公式2-△△Ct计算mRNA相对表达水平。

1.7微板法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及髓过氧化酶(MPO)含量 断头取脑，冰生理盐水冲洗后加入组织提取液后使用匀浆器充分匀浆，4℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明步骤进行上样，使用酶标仪检测光密度值，并按说明书公式计算SOD、MDA及MPO含量。

1.8酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β含量 取大鼠脑组织，液氮研磨后制备脑组织匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清。按照说明书步骤加入标准工作液和待测液，使用酶标仪上机检测，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β含量。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.13组各时间点NDS评分比较 Sham组未见神经功能缺失症状。与Sham组比较，IR组和T组再灌注4、8、24、72 h(T1～T4)时NDS评分显著升高(P<0.05)；与IR组比较，T组T1～T4时NDS评分显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 3组各时点NDS评分比较分,n=4)

2.23组各时间点脑组织EB含量比较 与Sham组比较，IR组和T组T1～T4时脑组织EB含量显著升高(P<0.05)；与IR组比较，T组T1～T4时脑组织EB含量显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 3组各时点脑组织EB含量比较

2.33组各时间点脑组织MMP-2 mRNA及蛋白表达比较 与Sham组比较，IR组和T组T1～T4时脑组织MMP-2 mRNA及蛋白表达均显著升高(均P<0.05)；与IR组比较，T组T1～T4时脑组织MMP-2 mRNA及蛋白表达均显著降低(均P<0.05)，见表3。

2.43组各时间点脑组织MPA、SOD、MPO含量比较 与Sham组比较，IR组和T组T1～T4时脑组织MDA及MPO含量显著升高，SOD含量显著降低(P<0.05)；与IR组比较，T组T1～T4时脑组织MDA及MPO含量显著降低，SOD含量显著升高(P<0.05)，见表4。

2.53组各时点脑组织TNF-α及IL-1β含量比较 与Sham组比较，IR组和T组T1～T4时脑组织TNF-α及IL-1β含量显著升高(P<0.05)；与IR组比较，T组T1～T4时脑组织TNF-α及IL-1β含量显著降低(P<0.05)，见表5。

3 讨 论

线栓法是制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型的常用方法之一，其操作简单、重复性好且可灵活调整缺血及再灌注的处理时间。本研究显示，IR组大鼠在采用线栓法进行脑缺血2 h再灌注后出现左前肢不能伸展、爬行时向左侧转圈等行为，NDS评分及血脑屏障通透性明显升高，脑组织炎性因子水平及氧化应激水平表达明显升高，表明模型制备成功。

研究表明，脑缺血再灌注损伤的病理生理过程主要包括能量耗竭、酸中毒、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、氧自由基损伤、炎性细胞因子损伤及一氧化氮毒性作用等病理机制〔7～9〕，除缺氧和能量代谢衰竭外，由缺血诱导的一系列瀑布样效应是导致缺血性神经元凋亡的重要机制。本研究提示大鼠在脑缺血再灌注损伤可出现血脑屏障损伤、大量炎性因子释放及氧化应激损伤，从而出现脑损伤。

血脑屏障作为机体维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构基础，在脑缺血再灌注损伤中占有重要地位。血脑屏障损伤是脑缺血的重要表现，而血脑屏障损伤又将进一步加重脑损伤，引起脑水肿、氧化应激损伤及炎性反应等，甚至导致脑死亡〔10〕。MMPs在正常脑组织中不表达或低表达，当脑缺血再灌注时，MMPs激活导致血脑屏障通透性增加，引起血管源性脑水肿及继发性神经炎性反应，并导致神经细胞损伤〔11〕。血管基底膜与细胞外基质是维持血脑屏障完整性的重要结构基础，而MMPs是一类能降解细胞外基质成分的蛋白水解酶，其中MMP-2为明胶酶，是MMPs家族中的主要成员，在正常的脑组织中呈低水平表达，并与TIMP-2共同形成随时间变化的动态平衡，维持细胞外基质的稳定。研究发现在脑缺血再灌注后，MMPs与TIMPs平衡失调，MMP-2的表达增加，MMP-2通过降解细胞外基质导致血脑屏障的通透性增加，促进炎性反应的发生，在脑缺血再灌注和出血转化过程中扮演重要的角色〔12，13〕。本研究参照Szychowski等〔14〕研究并结合预实验结果选择TIMP-2的给药方式及计量，结果提示TIMP-2可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，其机制与其减轻大鼠氧化应激损伤、降低炎性反应、改善血脑屏障的通透性及下调MMP-2表达有关。TIMPs是MMPs特异性抑制因子，其通过与酶和酶原的催化位点结合，使酶失活或阻止酶的活性。TIMP-2是一种可溶性分泌蛋白，其可选择性抑制MMP-2，对抗MMP-2的活性，减轻脑缺血再灌注后的神经损伤，促进神经功能的恢复〔15〕。

综上，TIMP-2可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，其机制与下调MMP-2表达有关。