成都地区471994例新生儿耳聋基因筛查突变情况分析

邹凌蔡娟杨馨婷张冠斌

1成都市妇女儿童中心医院（成都610031）

2生物芯片北京国家工程研究中心,北京102206.成都博奥独立医学实验室（成都611130）

听力障碍是人类常见的出生缺陷之一，我国每年新增6～ 8万耳聋新生儿[1]。耳聋病因复杂，60%与耳聋基因遗传相关，数据显示，非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋类型，占遗传性耳聋的70%，可以分为常染色体显性(DFNA，15%～20%)、常染色体隐性(DFNB，80%)、性连锁(DFN X-linked，l%)和线粒体遗传(1%)四类[2]。非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss，NSHL)已知的致聋基因已有121个,涉及常染色体显性遗传49个，隐性遗传76个，X-连锁遗传5个，1000多种致病变异[3]。本研究中，我们对成都市22个区（市）县2016年7月-2019年6月出生的471994名新生儿应用遗传性耳聋基因芯片进行耳聋基因筛查，用以评估成都市不同区域新生儿中常见遗传性耳聋基因的突变频率和类型。

1 对象与方法

1.1 对象

2016年7月至2019年6月，对成都市22个区（市）县出生的471994名新生儿进行耳聋基因筛查。

1.2 方法

1.2.1 采集血片

22个区(市)县的产科执业机构专业人员与新生儿监护人签署知情同意书后，填写信息卡，按卫生部《新生儿疾病筛查技术规范》（2010年版）采集新生儿足跟血，制成滤纸干血片。

1.2.2 核酸提取

用打孔器取直径为6mm的干血斑1片至1.5mL离心管中，使用天根生化的口腔拭子基因组提取试剂盒，按照操作规程进行DNA提取，并应用NanoQ微量分光光度计测定DNA浓度，满足浓度>2ng/μL，储存于-20°C备用。

1.2.3 核酸扩增

应用基于微阵列芯片法的十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒检测15个常见耳聋基因突变位点(博奥生物)，包括 GJB2基因(c.35delG、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT)、GJB3基因(c.538C>T)、SLC26A4基因(c.919-2A＞G、c.2168A＞G，c.1174A＞T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.1707+5G>A)、线粒体12SrRNA基因(m.1555A>G、m.1494C>T)。每份核酸扩增时，分为A、B、C三个体系，每个体系均为多重扩增，包含20μL扩增混合物和5μL模板DNA。A、B、C三管的热循环程序相同，按照试剂盒说明书进行设置。

1.2.4 产物杂交

扩增后，从同一份核酸样品的三管扩增产物中分别取20μL产物充分混匀，然后加入30μL按照说明书预先制备好的磁珠悬液，混匀后静置10 min，随后借助磁力板上除去上清。加入新配制的0.1M NaOH 120µL，混匀后反应10 min，除去上清。加入40μL杂交缓冲液，混匀后除去上清；加入20μL杂交缓冲液混匀后获得杂交液。将芯片及盖片依次放入杂交盒,取15.5μL上述制备好的杂交液加到微阵列芯片的点阵上，密封杂交盒，放入50℃水浴锅中，杂交1h。

1.2.5 杂交后洗片

按照说明书依次配制好洗液I和洗液Ⅱ。从杂交盒中取出芯片插入清洗槽中的芯片架，启动清洗程序，自动完成洗液I和洗液Ⅱ的清洗。清洗结束后，把芯片架挂到离心架上，1000 r/min离心2 min。

1.2.6 扫描读片

用芯片扫描仪LuxScan-10K/B和耳聋基因检测分析系统进行芯片扫描和结果判断。

1.3 质量控制

DNA提取、PCR扩增、杂交过程的所有试剂及器皿均进行严格的消毒。对无法判断结果的样品进行重复实验，并随机抽取5%样品进行重复实验。DNA浓度测定按照5%进行抽检，浓度均达到实验要求。所有阳性检测结果均使用一代测序进行复核，线粒体突变还增加一次芯片法复检，野生型结果随机抽检1%使用一代测序进行复核。

1.4 统计学方法

利用SPSS18.0软件，采用卡方检验进行数据的分析与比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体阳性检出情况

筛查471994名新生儿，检测出突变携带者19016例，阳性携带率4.03%（19016/471994），其中GJB2单基因阳性检出率最高，为2.20%（10382/471994），其次由高到低分别为SLC26A4基因1.27%（6010/471994）、线 粒 体 12SrRNA0.33%（1545/471994）（含59例复合性突变中有线粒体12SrRNA突变）、GJB3基因 0.20%（928/471994）及多基因复合突变0.04%（210/471994），其中纯合/复合杂合突变82例。各基因型中，GJB2基因c.235delC单杂合突变型的检出率最高，为1.75%（8279/471994）；其次为SLC26A4基因c.919-2A>G单杂合突变型（检出率为0.84%，3968/471994）。具体19016例耳聋基因阳性突变携带者基因突变情况表见表1。

表1 19016例阳性突变携带者基因型Table 1 The genotype of 19016 positively detected patients

上接表1

2.2 等位基因突变频率

2.2.1GJB2基因

如表2所示，本研究共检出10553例GJB2基因阳性携带者，其中纯合/复合杂合突变54例（含1例多基因突变的纯合突变），杂合突变10329例，含GJB2基因的多基因突变170例。GJB2基因等位基因突变频率为 50.26%（10607/10553×2），其中c.235delC最高，为39.94%（8429/10553×2），其次分别 为 c.299_300delAT（8.00%）、c.176_191del16（2.04%）及c.35delG（0.28%）。

表2 10553例GJB2基因阳性携带者等位基因突变频率Table 2 The mutant allele frequency in GJB2 among 10553 positively detected patients

2.2.2SLC26A4基因

如表3所示，本研究共检出6149例SLC26A4基因阳性携带者，其中纯合/复合杂合突变28例（含1例多基因突变的复合杂合突变），杂合突变5983例，含SLC26A4基因的多基因突变138例。SLC26A4基因等位基因突变频率为50.23%（6177/6149×2），其中c.919-2A>G突变频率最高，为32.79%（4032/6149×2），其次为 c.1229 C>T（6.27%）和c.2168A＞G（3.91%）。

表3 6149例SLC26A4基因阳性者等位基因突变频率Table 3 The mutant allele frequency in SLC26A4 among 6149 positively detected patients

2.3 不同区（市）县阳性突变携带者检出情况

对19016例耳聋基因阳性突变携带者按照新生儿出生地区（市）县进行统计分析，邛崃（4.49%，c2=8.04，P=0.005）和简阳（4.32%，c2=5.22，P=0.026）的总突变率明显高于成都市平均水平。温江（3.71%，c2=5.41，P=0.020）和新都(3.74%，c2=4.67，P=0.031)的突变率明显低于成都市平均水平。采用卡方检验，P<0.05，差异有统计学意义。其中线粒体12SrRNA突变率：大邑（0.47%，c2=7.96，P=0.005）和简阳（0.42%，c2=5.36，P=0.021）的携带率明显高于成都市平均水平，蒲江（0.17%，c2=5.47，P=0.019）、青白江（0.21%，c2=4.19，P=0.041）和温江（0.24%，c2=5.04，P=0.025）明显低于成都市平均水平。采用卡方检验，P<0.05，差异有统计学意义，具体统计结果见表4。

表4 以新生儿出生地统计22个区（市）县筛查结果(卡方检验）Table 4 The carried rate of gene in the 22 districts and counties(chi-square test)

3 讨论

本研究项目中，成都地区新生儿耳聋基因阳性突变携带率为4.03%（19016/471994），与前期成都地区吕康模等[4]研究中检出的携带率3.19%（542/17000）相比明显增高，考虑是与所检测的耳聋基因突变位点数增加有关。2014年吕康模等[4]只检测了4个基因的9个位点，而本研究中，检测的突变位点数增加到15个，新增的6个突变位点（SLC26A4基因c.1174 A＞T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.1707+5G>A)等位基因突变频率合计为13.5%（1664/12298）。由于检测位点数的增加，阳性携带者的检出率也增高，而且增加的这6个位点都是与大前庭导水管综合征密切相关SLC26A4基因突变位点，更加有利于大前庭导水管综合征的高危人群的早发现早诊断。与全国数据相比较，本研究与阮宇等[5]北京地区新生儿检测4个基因9个位点检出的携带率4.51%(3412/75649)，潘丽等[6]珠海地区新生儿检测4个基因20个位点检出的携带率4.15%（406/9775）相一致；低于李晓泽等[7]山西长治地区新生儿检测4个基因9个位点检出的携带率5.15%（984/19113），潘蕾等[8]天津地区新生儿检测4个基因20个位点检出的携带率5.40%(4423/81929)；高于李玛等[9]广州地区新生儿检测4个基因9个位点检出的携带率3.68%(266/7234)，刘冬霞等[10]广东清远地区新生儿检测4个基因13个位点检出的携带率2.64%(96/3630)。可见，由于国内新生儿耳聋基因筛查方式、检测突变位点数以及所在地区均存在差异，耳聋基因阳性检出率不尽相同。成都地区新生儿的耳聋基因携带率处于全国的中间水平，基因突变仍是本地区先天性聋儿的主要病因。新生儿耳聋基因筛查能够从分子水平发现可能出现听力损伤的高危新生儿，明确听力损失的病因，还能了解当地的耳聋基因突变特点，为制定有针对性的耳聋预防和干预措施提供参考。目前针对耳聋基因导致的遗传性耳聋，人工耳蜗和助听器是最有效的手段[11]，早期明确病因后，可以更早地采取康复干预措施，把我们听力障碍诊治的目标从1-3-6:1月龄内筛查，3月龄内诊断，6月龄内干预，提高为1-2-3[12]，从而有效提高康复干预的效果，让更多耳聋婴幼儿尽早回到有声世界，融入主流社会。

以等位基因突变频率计算，本研究GJB2基因中c.235delC突变频率最高，为39.94%，其次分别为c.299_300delAT（8.00%）、c.176_191del16（2.04%）及c.35delG（0.28%）。SLC26A4基因中c.919-2A>G突变频率最高，为32.79%，其次为c.1229 C>T（6.27%）和c.2168A＞G（3.91%）。戴朴等[13]2019年研究报道的GJB2基因常见致病突变位点为c.235delC，突变频率为61.00%，其次为c.299_300delAT（14.88%）；SLC26A4基因常见致病突变位点为c.919-2A>G，突变频率为51.99%，其次为c.2168A＞G（10.34%）。本研究与之比较，GJB2基因突变谱一致；而SLC26A4基因突变谱具有地域特异性，c.1229C>T的突变频率高于c.2168A＞G，为仅次于c.919-2A>G的第二常见致病突变位点。但本研究的等位基因突变频率均低于戴朴等[13]的报道，原因在于，本研究的研究对象为新生儿中致聋基因突变阳性携带者，而非戴朴等[13]研究中的携带致聋基因突变的耳聋患者，但仍可说明，GJB2和SLC26A4为成都地区新生儿常见致聋基因。由于耳聋基因芯片筛查位点数的限制，本研究中筛查的GJB2和SLC26A4基因12个位点并未包括全部已知致病位点，GJB2和SLC26A4基因中分别有19.82%和22.68%的致病突变位点未能检测到[13]。所以，对于有基因位点单杂合突变，又有听力损失的新生儿一定要进行诊断性基因测序检测，排除少见致聋位点突变可能性，尽可能明确听力损失的病因，做到更有效地个体化、精准康复干预。同时，完善耳聋基因筛查随访体系[14]，对于所有耳聋基因阳性携带者都应定期随访其听力情况。

本研究中，成都市共筛查出线粒体耳聋基因携带者1545例。这些新生儿均为耳毒性药物敏感个体，同时这些患儿家庭中平均存在10个以上的母系成员，他们也因携带同样基因突变而为药物性耳聋敏感个体，要及时向整个母系家族成员进行宣教，通过科学用药指导来有效避免药物性耳聋的发生。这些敏感个体在成都市不同区县分布很不均衡，以出生地进行统计，大邑和简阳的线粒体基因突变携带率最高，需要特别加强这两个区域的科学用药指导宣传，尤其针对携带者的母系家族成员应避免使用耳毒性药物。究其原因，考虑线粒体突变遵循母系遗传，女性阳性携带者区域内婚配可能是主要因素，环境等其他原因还需进一步研究调查。

本研究调查结果显示，成都的22个区(市）县中，邛崃和简阳的新生儿耳聋基因突变携带率明显高于平均水平，其父母中单方或双方携带者比率也较高，生育二胎时为阳性携带者甚者耳聋患儿的比率也同样较高。建议这些阳性携带者的父母及家族成员在生育二胎之前一定要先进行耳聋基因检查，在婚配和生育时也需要明确其配偶耳聋基因携带情况，必要时要进行产前诊断及干预，避免先天性聋儿的出生。把邛崃和简阳做为育龄青年和家庭优生优育健康教育宣传的重点区域，在常规婚检和孕检中增加耳聋基因筛查项目，针对育龄人群开展科普宣教和遗传咨询。

4 结论

成都市新生儿耳聋基因筛查已经从四个基因9个位点增加到了四个基因15个位点，筛查出来的阳性突变携带率也从3.19%增加到4.03%。同时研究发现成都地区SLC26A4的突变谱具有地域特异性，c.1229C>T的突变频率高于c.2168A＞G，为仅次于c.919-2A>G的第二常见致病突变位点。另外成都地区耳聋基因包括线粒体12SrRNA突变携带率在不同区（市）县分布不平衡，在今后的耳聋出生缺陷防控工作中针对高突变携带率的区（市）县更应加强健康教育，阳性人群婚配、生育指导及耳毒性药物的合理使用。