猪高致病性蓝耳病的病理形态学观察

龚义美，李晒阳

（1.湖南省泸溪县畜牧水产事务中心，湖南泸溪416100；2.平江县动物疫病预防控制中心，湖南平江414500）

猪蓝耳病又称猪繁殖和呼吸障碍综合症（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的。该病最初出现的时候，由于病原不明确和难以治疗，因而被称为“神秘猪病”，且染病猪的耳朵、外阴、腹部等部位因其内血液氧化不足而呈现出皮肤紫绀，故而又被称为“蓝耳病”。临床上在母猪主要表现繁殖症状，如流产、死胎、木乃伊胎和弱胎等，另外就是呼吸道症状明显，特别是仔猪，出现呼吸困难、食欲下降、消瘦等，由于机体抵抗力下降，更易导致继发感染，复杂病情，治疗效果及预后均不理想。

近年来，由于非洲猪瘟的影响，一些猪场对蓝耳病关注有所下降，其实在实际生产中，除目前威胁最大的非洲猪瘟外，蓝耳病对猪场的影响是最大的。因此，做好蓝耳病的综合防控工作，对于稳定猪场的生产具有重要意义。临床上，对于蓝耳病的诊断目前主要以PCR方法为主，辅以抗体监测来评判猪场的感染情况，但猪场的感染发病大都是多因素共同作用的结果，没有详细的跟踪检测佐证，往往很难对一些病例的原发因素进行定性，增加了防控难度和效果。本文所述病例，是在确诊为蓝耳病感染后，对送检病样制作感染猪肺、肾组织的病理切片并进行观察，掌握其病理变化，为蓝耳病的致病机理及丰富临床诊断提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

湖南省泸溪县某猪场发生蓝耳病病死猪内脏器官。

1.2 仪器及试剂

石蜡切片机、显微镜、显微镜摄像仪、计算机、二甲苯、伊红、福尔马林、碳酸锂饱和液等。

1.3 组织切片制作方法

1.3.1 取材：取病变部位、正常组织二者汇合处的实质脏器（如心、脾、肾或是淋巴结），注意常规即可。

1.3.2 固定：将所取病料剪成1.5cm×1.5cm×0.5cm大小的组织块，放进10%福尔马林液中予以固定，时间48h；固定6h左右，需要对组织块做出初步的修块动作。而后，将组织块置于一个小包埋盒内，按要求开始脱水、浸蜡，详细步骤：10%甲醛1h→80%酒精1h→90%酒精1.5h→95%酒精2h→95%酒精2h→100%酒精1h→100%酒精1.5h→100%酒精1.5h→二甲苯0.5h→二甲苯1h→石蜡2h→石蜡2h。

1.3.3 包埋：该过程均是在包埋机上进行，事先对包埋机进行设定，通常为2个小时。从脱水筐内取出一个小包埋盒，将它置于进入工作状态的蜡缸内。该情况下，丢弃包埋盒上的盖子，从盒中取出包块，可以使用一把小镊子。需要说明的是，取出时要将切面朝下，水平放在不锈钢包埋盒的正中央。若不然，可能无法切完全。摆放组织块后，将一个小包盒底端置于不锈钢包埋的最顶端，而后铺上满石蜡。将包埋完毕的小包埋盒置于一个冷冻台上，让石蜡得到凝固。一旦组织块能够和石蜡之间完全地结合，将包埋盒从组织块底端予以抽出，将小包埋盒侧面留下的石蜡予以刮去。

1.3.3 切片：将小包埋盒内部的组织块拿出，并于石蜡切片机上予以固定，先开始修片。修至组织时，要将厚度更改为5～7μm，而后重新切片。注意控制好力度，接连开始切片。

1.3.4 摊片、烘片：将切下来的组织薄片缓缓地挑起，以小镊子来夹起它的起始部，置于展片水槽中，（提前就已经将水槽调整为一种工作状态），45℃～50℃。一旦温度太高，切片会意外地熔化。如果太低，切片又无法得到伸展。将切片置于一个展片槽内，以小镊子将它的皱缩部位予以展平，此时将已准备好的载玻片垂直伸入到载玻片上的1/3处，捞起其中的薄层切片。此时，切片也会自动地在载玻片上进行粘附，将载玻片放在切片架上，将它置于摊片架上。将切片架转移到一个烘片箱内，对其烘干（温度76℃），一般持续时间为40min。

1.3.5 脱蜡、染色：将染色架置于二甲苯Ⅰ内开始浸泡10min→转入二甲苯Ⅱ中再次浸泡，10min（脱蜡）→95%酒精2 min→85%酒精2 min→80%酒精2 min→苏木素染液染色3～5min→水洗（将切片架放入事先准备好的清水中冲洗2 min）→1%盐酸酒精分化（本操作是重点，作用是对胞浆着色予以洗脱，时间太久，胞核也会开始失去它的着色。）立即取出，通常4～6s→流水下冲洗15～30min→伊红染色1～3min→85%酒精3s→95%酒精3s→100%酒精3s→100%酒精3s→二甲苯Ⅱ3s。到这一步，H.E染色也基本上已经完成，将染色架上放好的载玻片予以拿下来，用一块纱布蘸取表面上的二甲苯液体，滴入几滴中性树胶，同时盖上它的盖玻片，贴好对应的标签，置于切片盒内，观察各脏器是否有其他病理变化。

1.4 病理学组织观察方法

将切片放在显微镜载物台上，用低倍镜观察，调节光圈和反光镜，使视野明亮。之后先调粗准焦螺旋，后调细准焦螺旋，直至物象清晰。调节切片位置即视野范围，将细胞组织置于视野中央。换用高倍镜，调节细准焦螺旋，使物象清晰，观察病理学组织形态。拍摄照片时，将3个包埋盒粘在一起作为支撑工具，靠近显微镜目镜侧开孔尽量大些。直接把支撑工具用左手固定在镜头正中央，手机设置到最高分辨率（长宽比为4∶3），右手持手机，摄像头对准镜头中央拍摄。

2 结果

（1）肺脏：小血管和毛细血管扩张，内充满红细胞，肺泡腔内有大量红染浆液和丝网状的纤维蛋白（图1），肺小叶间质增宽，中有大量红染浆液。

图1 肺泡腔内有浆液和丝网状的纤维蛋白

（2）肾脏：肾小管可见颗粒甚至是水泡变形，其上皮细胞严重地肿胀，管腔也开始变狭窄，形状类似星芒，病猪的毛细血管也大幅扩张，红细胞多（图2），严重者空泡占据整个胞浆而呈气球样变甚至胞膜破裂，部分肾小管上皮与基底膜分离（图3），脱落于管腔中，胞浆红染，上皮细胞核出现固缩和溶解消失（图4），间质毛细血管扩张充血。

图2 毛细血管充满红细胞

图3 肾小管颗粒变性和水泡变性

图4 细胞核固缩和溶解

3 讨论与分析

3.1 蓝耳病对肺脏结构和功能的影响

肺脏病变明显表明机体处于呼吸困难的状态，间隔增宽同时检测出炎性细胞浸润。这就说明：毛细血管也改变了原始的通透性，其内皮严重受损。部分血浆蛋白已穿透毛细血管，并侵袭到了病猪身体的肺泡腔中，血浆里面的其它不同成分同业也渗入到了肺泡间隔中，从而加剧了宽度，使其形成间质性肺炎。从气肿或是萎缩来看，肺泡气体在实际交换中也备受干扰，病情恶化后，肺脏也将丧失正常的功能。

3.2 蓝耳病对肾脏结构和功能的影响

肾的核心构成为泌尿小管，以及部分间质组织，其中分布较多的血管。泌尿小管，涵盖了肾单位以及集合小管这2个不同的部分。代谢时，机体也会分泌较多的代谢产物，特别是蛋白质分解。顺着血液的方向开始循环，直至肾脏；后经肾转变为尿液，从尿道中顺利地排出。网内皮细胞变性或是坏死，由肾小球毛细血管渗出的纤维素进入肾小囊囊腔，毛细血管网已看不到红细胞，肾脏贫血。肾上皮细胞已经出现凝固性坏死，肾小球的滤过机能和肾小管的重吸收作用大大降低。

综上所述，当猪发生蓝耳病后，心脏、肺脏、肝脏等各实质脏器均发生了广泛性病理损伤，从而在临床上出现一系列症状。

4 结论

根据研究报道，目前引起国内猪蓝耳病从病原来讲，一是主要由变异的猪蓝耳病病毒引起，是原发性病因；二是由其它病毒、细菌继发，甚至寄生虫交叉或是继发感染，往往造成病死率上升。因此，蓝耳病的有效防控对于规模猪场的稳定生产影响巨大。另外，蓝耳病的发生、发展、预后均与猪场管理、基础免疫、空气质量和防控条件等息息相关，需要一个综合全面的防控。在结合临床症状、实验室诊断的前提下，本文对确诊病猪组织样进行病理学组织观察，其结果显示，猪只发生高致病性蓝耳病时，其肝脏器受损甚至出血，特别是肺、肾脏也会造成病理性损伤，其中肺脏实变和肾脏的肾小管出现颗粒变性和水泡变性均为典型的临床病变，揭示了高致病性蓝耳病对猪群脏器的影响，为蓝耳病的致病机理及丰富临床诊断提供依据和参考。