半夏泻心汤“辛苦组”药物提取液纯化工艺研究

冯玉天娇，陈 雪，黄庆德

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

半夏泻心汤出自张仲景的《伤寒论》，为治疗脾胃病的经典方，主治心下痞证，临床主要用于治疗急慢性胃炎、消化道溃疡、急性胃肠炎。半夏泻心汤是充分体现中药性味配伍理论的代表方，方中“甘补”组药物由党参、大枣、甘草组成，作用为补中益气，养胃，以防辛散耗气，苦寒伤胃；“辛开苦降”组药物由半夏、干姜、黄芩、黄连组成，作用为辛温除寒，和胃止呕，苦降泻热，清肠消痞，主要通过促进胃动力、促进胃黏膜修复、抗幽门螺杆菌等达到消痞散结的目的［1-4］，其主要作用部位为胃部。为更好发挥药效，提高药物的生物利用度，使方中“辛开苦降”组药物可在胃部滞留较长时间且稳定地释放药物，将“辛开苦降”组药物经提取、纯化后，应用现代制剂技术制成胃滞留释药单元，在胃中缓慢释药，起辛开苦降，调畅气机的作用，达到消痞散结的目的；另将“甘补”组中药物经提取、纯化后，制备成胃溶型普通释药单元，口服后迅速释放药物，起补中益气、养胃的作用，以防辛散耗气，苦寒伤胃。将上述胃滞留释药单元和胃溶型普通释药单元共同组合成为二元释药系统，改变这些组分在体内的释药行为，从而达到强化组分药性、优化整体协同的作用，充分发挥中药复方的优势。这既可体现中药复方的整体性，又可以兼顾其复杂性，同时体现了传统中医药理论和现代制剂理论的融合。由于半夏泻心汤“辛开苦降”组药物经乙醇回流提取的收膏率为20%左右［5］，但胃部滞留制剂载药量一般较小，为减小单服剂量，便于应用现代制剂技术将其制成胃滞留释药单元，本实验以盐酸小檗碱、黄芩苷的静态转移率为指标，采用单因素试验与正交设计法对半夏泻心汤“辛开苦降”组药物的大孔吸附树脂纯化工艺进行考察，为下一步半夏泻心汤“辛苦组”药物胃滞留释药单元的研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪、SPD-M20A PDA检测器（日本岛津公司）；XS105电子分析天平（美国梅特勒-托利多仪器有限公司）；FA2004N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；STARTER 3100 pH酸度仪（美国奥豪斯公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；DLSB-5／20低温冷却循环泵；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-2000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DKZ系列电热恒温振荡槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药 法半夏、干姜、黄芩、黄连购自安徽省亳州市沪谯药业有限公司，经福建中医药大学药学院杨成梓教授鉴定，分别为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit干燥块茎、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc的干燥根茎、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根、毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch的干燥根茎。黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201318，纯度：93.3%）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212，纯度：＞98%）；色谱乙腈、色谱甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；乙醇等其他试剂均为分析级；AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附树脂材料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 上样溶液的制备 取法半夏、干姜、黄芩、黄连，加入10倍量的65%乙醇溶液加热回流3次，每次2 h，滤过，合并3次提取液，减压回收至无醇味，加水稀释至一定质量溶度，即得。

2.2 HPLC法同时测定黄芩苷与盐酸小檗碱含量

2.2.1 混合对照品贮备溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱0.98 mg和在60℃减压干燥4 h的黄芩苷3.20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“2.1”项下的上样溶液于大孔吸附树脂中上样，用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Diamonsil®C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%磷酸水＝25∶75；柱温：35℃；流速：1 mL／min；进样体积：5μL；检测波长：270 nm。

2.2.4 标准曲线的制备 精密吸取混合对照品贮备溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液。分别吸取不同浓度的对照品溶液5μL于液相中，按照“2.2.3项”下色谱条件测定峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照品进样量X为横坐标，进行线性回归，得黄芩苷回归方程：Y＝16 358X－72 288，r＝0.999 9，表明黄芩苷在0.032～0.800μg范围内线性良好；盐酸小檗碱回归方程：Y＝19 556X－5 027.7，r＝0.999 9，表明盐酸小檗碱在0.009 8～0.245 0μg范围内线性良好，色谱图见图1。

图1 混合对照品与70%乙醇洗脱液的HPLC色谱图

2.3 大孔吸附树脂的预处理 取适量AB-8型大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀，溶胀后湿法装柱。用95%乙醇清洗树脂，检查流出液，至流出液与水混合（1∶5）不呈白色浑浊为止，再用大量蒸馏水将树脂洗至无醇味即可，备用。

2.4 AB-8型大孔吸附树脂纯化工艺研究

2.4.1 泄露曲线的绘制及树脂最大吸附量的确定

精密称取已预处理的AB-8大孔吸附树脂22 g，装柱（1.8 cm×40 cm），柱体积约40 mL（下文树脂装柱与此一致）；取浓度为12.0 mg／mL上样溶液，以2 BV／h流速上样吸附，按份收集流出液，每份20 mL（0.5 BV）；测定流出液中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算累计流出液中黄芩苷和盐酸小檗碱的泄露百分率，以泄露率为纵坐标，累计流份为横坐标绘制泄漏曲线，结果见图2。

图2可知：收集流出液至第90份（45 BV）时，盐酸小檗碱的泄露率为3.2%左右，黄芩苷的泄露率为9.2%，接近10%的泄漏点，故确定最大上样量为40 BV，即最大上样量（饮片量）为19.2 g。

图2 黄芩苷和盐酸小檗碱泄露曲线

最大上样量（饮品量）＝柱体积×最大上样量×样品浓度

2.4.2 吸附与洗脱条件的单因素考察

2.4.2.1 上样液浓度考察 照“2.1”项下方法，制备浓度分别为10、15、20、25、30 mg／mL上样液，每份含中药饮片量为19.2 g；以4 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再以70%乙醇4 BV／h流速进行洗脱，收集5 BV的洗脱液，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。结果表明在上样液浓度为20、25 mg／mL时，黄芩苷、盐酸小檗碱的转移率差别不大；但上样液浓度大于25 mg／mL时，出现絮状沉淀，堵塞树脂柱。故确定上样液浓度为20 mg／mL。见图3。

图3 黄芩苷和盐酸小檗碱上样液浓度考察

转移率／%＝（洗脱液中样品浓度×洗脱体积／上样液中样品浓度×上样体积）×100%

2.4.2.2 上样液pH值考察 取浓度为20 mg／mL上样液，分别用1.0 mol／L HCL和1.0 mol／L NaOH调pH值为2、4、6、8、10；以4 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再以70%乙醇4 BV／h流速进行洗脱，收集5 BV洗脱液，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。结果表明上样液pH值分别为4、6时，黄芩苷和盐酸小檗碱的转移率均较高，且上样原液pH为4.5左右，故确定用原液作上样液。见图4。

图4 上样液pH值考察

2.4.2.3 上样流速考察 取浓度为20 mg／mL上样液，分别以2、3、4、5、6 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再以70%乙醇4 BV／h流速进行洗脱，收集5 BV洗脱液，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。结果表明上样流速对黄芩苷和盐酸小檗碱的转移率影响不大，考虑效率及减轻对树脂的影响，故确定上样液流速为4.0 BV／h。见图5。

图5 黄芩苷和盐酸小檗碱上样液流速考察

2.4.2.4 梯度洗脱曲线 取浓度为20 mg／mL上样液，以4 BV／h流速上样吸附后，先用5 BV蒸馏水洗脱杂质，再依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇各5 BV进行洗脱，洗脱流速为4 BV／h，分段收集洗脱液，每1 BV的流出液为一流份；测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率；以流份为横坐标，黄芩苷和盐酸小檗碱的转移率为纵坐标，绘制梯度洗脱曲线。结果显示：30%乙醇洗脱液（10→15）中出现少量的黄芩苷和盐酸小檗碱，50%乙醇洗脱液（15→20）已洗脱大部分的黄芩苷和盐酸小檗碱，70%乙醇洗脱液（20→25）中含少量的黄芩苷和盐酸小檗碱。表明50%～70%乙醇能将大部分黄芩苷和盐酸小檗碱洗脱下来，因此选择50%、60%、70%乙醇进行进一步的浓度筛选。见图6。

图6 黄芩苷和盐酸小檗碱的梯度洗脱曲线

2.4.2.5 洗脱剂浓度的选择 取浓度为20 mg／mL上样液，以4 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再分别用50%、60%、70%乙醇洗脱，各收集洗脱液200 mL，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。黄芩苷的洗脱率分别为75.62%、87.82%、89.99%，盐酸小檗碱的转移率分别为78.62%、95.52%、96.40%。结果表明70%乙醇洗脱液对黄芩苷和盐酸小檗碱的洗脱能力较强，故选用70%乙醇作为洗脱剂。

2.4.2.6 洗脱剂用量的考察 取浓度为20 mg／mL上样液，以4 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，每份为1 BV，至流出液无颜色，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量。以流份为横坐标，累积洗脱率为纵坐标，绘制洗脱曲线。结果显示当洗脱液用量达4 BV后，黄芩苷和盐酸小檗碱的累积洗脱率不再增加，故确定洗脱剂用量为4 BV。见图7。

图7 黄芩苷和盐酸小檗碱的洗脱曲线

累积洗脱率／%＝累计洗脱液中样品含量／上样液中样品含量×100%

2.4.2.7 洗脱剂pH值的考察 取浓度为20 mg／mL上样液，以4 BV／h流速上样吸附后，先以5 BV蒸馏水洗脱杂质，再用pH分别为4、6、8的70%乙醇进行洗脱，收集4 BV的洗脱液，测定洗脱液中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。结果显示黄芩苷的转移率分别为81.81%、85.99%、88.30%，盐酸小檗碱的转移率分别为85.09%、91.06%、96.92%，表明pH值为8的70%乙醇洗脱液对黄芩苷和盐酸小檗碱的洗脱能力较强，故选用pH值为8的70%乙醇作为洗脱剂。

2.4.3 正交试验优化AB-8型大孔吸附树脂的吸附条件

2.4.3.1 因素-水平设计 根据单因素实验结果，选择上样液浓度（A）、上样液pH（B）、上样流速（C）3个因素作为考察对象，用正交试验表L9（34）安排9次试验，以综合评分作为评价指标，即Y＝40%×（X1／X1max）＋40%×（X2／X2max）＋20%×（2－X3／X3min），对实验结果进行分析。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平表

2.4.3.2 实验方法 精密称取已预处理的AB-8大孔吸附树脂22 g，装柱（1.8 cm×40 cm），柱体积约40 mL。按表2中的条件进行上样后，先以5 BV蒸馏水洗脱，再用pH＝8的70%乙醇以4 BV／h流速洗脱，收集4 BV洗脱液，测定其中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，计算转移率。结果见表2。

2.4.3.3 干膏率测定 精密吸取正交试验洗脱液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，置于105℃的烘箱中，烘干3 h后放入干燥器中冷却30 min，精密称量，计算干膏率。结果见表2。

2.4.3.4 结果分析 由表2可知：各因素对大孔吸附树脂吸附结果的影响为A＞C＞B，即上样浓度对大孔吸附树脂吸附影响最大，其次是上样流速、上样pH。由表3方差分析结果可知：上样浓度对大孔吸附树脂的吸附有显著影响（P＜0.01），而上样pH、上样流速对大孔吸附树脂的吸附无显著影响（P＞0.05）。由表2、表3可得AB-8型大孔吸附树脂的吸附的优选条件为A2B1C2，即大孔吸附树脂的上样优化条件为上样液浓度为20 mg／mL，上样液pH值为4，上样流速为4 BV／h，先以5 BV蒸馏水洗脱，再用pH＝8的70%乙醇以4 BV／h流速洗脱，收集4 BV洗脱液。

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析

2.4.3.5 验证试验 根据正交试验的最佳工艺试验3批，结果见表4。表4显示黄芩苷和盐酸小檗碱的转移率分别为88.74%、94.53%，干膏收率为5.96%，与正交表结果相吻合，表明该纯化工艺稳定可靠。

表4 验证试验结果

3 讨 论

半夏泻心汤“辛开苦降组”中黄芩的主要有效成分为黄芩苷，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗变态反应等作用［6］，对胃肠道平滑肌有解痉作用［7］；黄连的主要有效成分盐酸小檗碱具有抗菌、抗炎、抗溃疡和免疫调节作用［8-9］，具有保护胃黏膜、促进胃溃疡愈合、抑制幽门螺杆菌（HP）的作用［10-11］。且半夏泻心汤治疗急慢性胃炎、消化性溃疡的作用，主要与黄芩苷、盐酸小檗碱对H P的抑制作用有关［12-14］。所以，将黄芩苷与盐酸小檗碱作为半夏泻心汤“辛开苦降组”组药物提取液纯化工艺的评价指标。

相关文献研究表明：前期以盐酸小檗碱、黄芩苷的静态吸附率及解吸率为指标，对大孔吸附树脂类型进行筛选，其中AB-8、HPD100对盐酸小檗碱、黄芩苷均有较高的吸附率和解吸率［15-16］。进一步对其进行动态吸附考察，结果显示AB-8的吸附速率常数要高于HPD100。所以，本文最后确定AB-8用于半夏泻心汤“辛开苦降组”药物提取液的纯化。

由于黄芩苷及盐酸小檗碱在水中的溶解度较低，提取液回收乙醇后用水稀释时，如果浓度过高，则会出现沉淀，导致出现堵塞大孔吸附树脂的现象，从而影响药液的纯化效果。所以，在考察上样液浓度时，上样液浓度都较低，一般为10～30 mg／mL。