金缕梅总酚的超声辅助提取工艺优化及其抗氧化、酪氨酸酶抑制作用研究

刘 辉，曾洁琳，梅 萍，高崧毅，赵子妍，刘 芳，杨安平

(佛山科学技术学院口腔医学院·广东 佛山 528000)

金缕梅，别名木里香、牛踏果，为蔷薇目、金缕梅科、金缕梅属落叶灌木或小乔木，多分布于四川、湖北、安徽、浙江、江西、湖南及广西等省区[1-2]。金缕梅，性味甘平，具有补中益气的功效。研究表明，金缕梅内含单宁质、槲皮素、山奈酚等化学成分[3]。金缕梅具有抑菌[4]、调节皮脂分泌、镇静、安抚的作用，对龟裂、晒伤、粉刺也有治疗作用[5]。

多酚类物质在抗炎、抗氧化等诸多方面具有较好的活性[6]。迄今为止，未见有关金缕梅中多酚提取及其抗氧化、抑制酪氨酸酶作用方面的研究，由于多酚类物质在高温下很不稳定，常规的回流提取效率较低，所以本文拟采用超声法提取金缕梅总酚，考察乙醇浓度、超声时间、液料比和提取次数对金缕梅总酚得率的影响，在上述实验基础上，通过正交设计实验优化提取条件，确定金缕梅总酚的最佳提取条件，以提取物的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率对其抗氧化能力进行评价，并评价了其抑制酪氨酸酶的作用，以期为金缕梅进一步开发应用提供科学依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 金缕梅：亳州键安堂有限公司；没食子酸标准品(纯度≥98%)：成都德思特生物技术有限公司。福林酚试剂、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、酪氨酸酶、二甲基亚砜、L-酪氨酸、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：上海麦克林生化科技有限公司；实验所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备 YRE-2000B旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；JJ224BC万分之一分析天平：常熟市双杰测试仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；UV-2700紫外分光光度仪：日本岛津公司；洁盟JP-040S超声波仪：深圳市洁盟清洗设备有限公司。

2 方法

2.1 金缕梅总酚的提取 金缕梅置于烘箱中45 ℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛，精密称取金缕梅粉末2.0 g，置于250 mL具塞三角瓶中，并按一定液料比加入一定浓度的乙醇溶液。然后在室温条件下进行超声提取，超声功率为240 W，用超声仪分别处理一定时间，取出后溶液立刻离心20 min(4 000 r/min)，取上清液，置于100 mL棕色容量瓶中，乙醇定容后测定总酚的含量。

2.2 样品总酚含量测定 标准曲线的绘制参照文献[7]，采用福林-酚比色法。配制浓度为2、4、6、8、10 mg/L的没食子酸标准溶液，分别取上述各溶液0.1 mL，加入0.5 mL的福林酚试剂和7.9 mL的水，反应5 min后，加1.5 mL的碳酸钠溶液(1g/L)，避光放置2 h后于765 nm处测定吸光值。得回归方程为y=0.077x+0.0074，R2=0.9997 (浓度范围为2～10 mg/L)。金缕梅提取液按上述同样方法处理，测定吸光值，根据回归方程计算总酚含量，结果以每克金缕梅中含有相当没食子酸的毫克数来表示(mg/g)。

2.3 单因素对总酚得率的影响 精密称取金缕梅粉末2.00 g，超声功率400 W，按料液比加入不同浓度乙醇溶液、不同超声时间和次数后，测定总酚含量。设定料液比1∶30 g/mL，超声时间10 min，不同浓度的乙醇溶液(20%、35%、50%、65%)，提取时间为10 min；选择50%乙醇溶液为溶剂，料液比1∶30 g/mL，置于不同提取次数(1、2、3、4次)提取10 min；提取次数为3次，溶剂为50%乙醇溶液，料液比1∶30 g/mL，分别提取不同时间(3、5、10、15 min)；提取次数为3次，按不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL)加入浓度为50%乙醇溶液，提取10 min。以金缕梅提取液中的总酚含量为考察指标。

2.4 正交实验的设计 根据单因素实验结果，按L9(34)正交试验表对提取条件进行优化设计，探讨最佳提取工艺，因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

2.5 工艺验证试验 通过正交实验得到最优超声提取金缕梅总酚的工艺条件，按照此工艺进行实验验证。

2.6 DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[8]方法并做适当修改。金缕梅提取液减压浓缩，得到金缕梅总酚提取物，配制成不同质量浓度的样品溶液，用于后续实验。配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液，以及浓度为1、2、3、4、5 g/L的样品溶液与阳性对照BHT溶液。精密移取0.1 mL不同浓度的样品与BHT溶液，再分别加入4.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，于暗处室温反应20 min，然后在517 nm波长处测定金缕梅总酚及BHT的吸光度，根据下列公式计算清除率。实验平衡操作3次。A0为DPPH溶液+无水乙醇的吸光值；A1为DPPH溶液+样品溶液的吸光值；A2为样品溶液+无水乙醇的吸光值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

2.7 ABTS自由基清除能力的测定 参照文献[9]方法并做适当修改。将25 mL 7.0 mmol/L ABTS溶液与25 mL 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，于暗处反应12～16 h，制备成ABTS溶液。用pH 7.4 10 mmol/L磷酸缓冲溶液将ABTS+·溶液稀释，至其在波长734 nm波长处的吸收值为(0.7±0.002)。分别精密移取0.1 mL不同浓度的样品和阳性对照BHT溶液，分别加入3.9 mL ABTS溶液，混合摇匀，室温条件下反应6 min后，在734 nm波长处测定其吸光值，按下列公式计算清除率。实验平衡操作3次。A空为ABTS溶液的吸光值；A样为3.9 mL ABTS溶液+0.1 mL样品溶液的吸光值。

ABTS的清除率(%)=[(A空-A样)/A空]×100

2.8 酪氨酸酶抑制实验 参照文献[10]方法并做适当修改。以10 mmol/L的L-酪氨酸为底物；配制浓度分别为0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g/L的金缕梅总酚和α-熊果苷阳性对照溶液；磷酸盐缓冲液为空白对照；将购买的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力为100 U/mL的酶溶液。

按表2剂量精确移取a、b、c、四组样液，置于37 ℃水浴中孵育10 min后，加入0.5 mL L-酪氨酸溶液，混匀，测得在475 nm处的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，实验重复3次，然后按下面的公式计算提取液对络氨酸酶的抑制率：

表2 抑制酪氨酸酶活性反应液组成

酪氨酸酶抑制率(%)=[1-(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]×100%

2.9 数据处理与分析 正交实验结果运用Minitab 17进行分析，测定结果以“平均值±标准差”表示，并采用Origin 9软件作图。

3 结果

3.1 单因素实验结果

3.1.1 乙醇浓度对金缕梅总酚提取量的影响 由图1可见，随着乙醇浓度的增加，金缕梅总酚的提取量先增加后下降，当乙醇浓度为50%时，提取率达到最大值0.628 mg/g。

图1 乙醇浓度对金缕梅总酚提取量的影响

3.1.2 超声时间对金缕梅总酚提取量的影响 由图2可见，金缕梅总酚的提取量在10 min时达到最大值0.752 mg/g。

图2 超声时间对金缕梅总酚提取量的影响

3.1.3 料液比对金缕梅总酚提取量的影响 由图3可见，在液料比为1∶10～1∶30(g/mL)之间时，金缕梅总酚的提取量逐渐增大，这可能是随着溶剂的增加，酚类物质的溶出逐渐增加，并在1∶30(g/mL)时达到最大值0.964 mg/g。

图3 料液比对金缕梅总酚提取量的影响

3.1.4 提取次数对金缕梅总酚提取量的影响 由图4可见，随着提取次数的逐渐增加，多酚的提取量也随之增加，但是提取3次后随着提取次数的增加酚类的提取量增加程度已经下降。考虑到提取时间、溶剂损耗及后续溶剂浓缩的能耗等因素，选择提取次数为3次。

图4 提取次数对金缕梅总酚提取量的影响

3.2 正交实验结果 正交实验与方差分析结果见表3、表4。从表3的K值可以确定超声辅助提取金缕梅总酚的最优条件是A3B2C3D3，即乙醇浓度65%、超声时间10 min、液料比1∶40 g/mL，提取次数4次。通过比较极差大小可知4个因素对金缕梅总酚的影响次序为：C(料液比)>D(提取次数)>A(乙醇浓度)>B(超声时间)。通过方差分析结果可知，A(乙醇浓度)、B(超声时间)、C(料液比)和D(提取次数)对金缕梅的总酚提取率均具有显著影响。通过验证实验可知，在此最佳提取工艺条件下金缕梅总酚的提取量为(0.95±0.03) mg/g。由此工艺条件得到的总酚得率与正交实验7号(A3B1C3D2)工艺条件下总酚得率较为接近，在实际应用中综合考虑提取效率、时间成本、回收溶剂过程中能源损耗等因素，确定较优工艺为A3B1C3D2，即乙醇浓度65%、超声时间5 min、液料比1∶40 g/mL，提取次数3次。

表3 正交实验结果

表4 方差分析结果

3.3 抗氧化实验结果

3.3.1 DPPH自由基的清除能力 见图5。金缕梅总酚对DPPH自由基具有较强的清除能力，IC50为644.2 mg/L,阳性对照BHT清除DPPH自由基的IC50为301.6 mg/L。实验结果表明，金缕梅总酚具备一定的清除DPPH自由基能力。

图5 金缕梅总酚对DPPH自由基的清除效果

R2=0.9999 (调整R2=0.9998)

3.3.2 ABTS自由基的清除能力 见图6。金缕梅总酚清除ABTS自由基的IC50为157.8 mg/L。阳性对照BHT清除ABTS自由基的IC50为279.2 mg/L。金缕梅总酚清除ABTS的作用明显好于BHT。以上实验结果表明，金缕梅总酚具备良好的清除ABTS自由基能力。

图6 金缕梅总酚对ABTS自由基的清除效果

3.4 酪氨酸酶抑制作用实验结果 抑制酪氨酸酶活性结果见图7。在浓度低于0.625 g/L时，金缕梅总酚抑制酪氨酸酶活性明显高于阳性对照α-熊果苷。当浓度高于0.625 g/L时，阳性对照抑制酪氨酸酶作用明显强于金缕梅总酚。金缕梅总酚与阳性对照α-熊果苷抑制酪氨酸的IC50值分别为0.597 g/L和0.6454 g/L。上述结果表明，金缕梅总酚具有较好的抑制酪氨酸酶活性。

图7 金缕梅总酚对络氨酸酶的抑制作用

4 讨论

本文采用超声辅助法对金缕梅总酚进行了提取，在单因素的实验条件下探索了乙醇浓度、超声时间、液料比和提取次数4个相关因素对金缕梅多酚提取量的影响，并用正交实验对金缕梅多酚的提取工艺进行了优化，确定了最佳工艺为：即乙醇浓度65%、超声时间5 min、液料比1∶40 g/mL，提取次数3次，在此条件下金缕梅总酚提取量为0.934 mg/g。在单因素实验中，当乙醇浓度大于50%时提取率降低的原因可能是由于随着乙醇浓度的增加，溶液极性也随之增加，根据相似相溶原理，此时不利于酚类物质的溶解[11]。当超声时间在10 min以内时，对细胞的破碎程度逐渐增加，导致酚类的提取量逐渐增大，10 min时细胞的破碎程度达到最大[12]。10 min后随着时间增加提取率下降的原因可能是由于超声导致溶液温度提高，破坏了多酚结构，使多酚类物质发生降解。正交实验极差分析表明，4个因素对总酚总酚提取量的影响次序为：料液比>提取次数>乙醇浓度>超声时间。方差分析结果也表明，4个因素均可显著性影响金缕梅总酚的提取率。从上述结果看出，最佳工艺选择与单因素分析结果具有一定差别，原因为单因素实验确定的最佳条件是局部最优条件，而正交实验确定的综合各因素下的最佳工艺条件，最后还要根据在实际应用中提取效率、时间成本、回收溶剂过程中能源损耗等因素来确定最终工艺条件。多酚类是发挥抗氧化作用的常见成分。DPPH法和ABTS法是检测抗氧化能力的常用方法[13-14]，本文采用上述两种方法对金缕梅总酚的抗氧化能力进行了检测。体外抗氧化实验表明，金缕梅总酚对DPPH自由基和ABTS自由基均具有明显的清除作用，对ABTS自由基的清除作用好于BHT。酪氨酸酶又称多酚氧化酶，在黑色素生成过程中发挥重要作用。通过抑制酪氨酸酶活性，可有效减少黑色素的生成，提高皮肤的白皙度[15-16]。本文对金缕梅总酚抑制酪氨酸酶作用进行了考察，结果表明，金缕梅总酚具有较强的抑制酪氨酸酶作用，在一定浓度范围内强于α-熊果苷。由此可见，金缕梅在抗氧化及抑制酪氨酸酶活性方面均具有较好的功效。本文的研究结果将为金缕梅的进一步开发利用提供科学依据。