基于液质连用技术的北青龙衣心肌组织成分分布研究

霍金海，程 团，孙国东，刘 政，王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

北青龙衣为胡桃科植物核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)的未成熟果实外果皮[1]，被2001年版《黑龙江省中药材标准》收载[2]；具有抗癌、定痛之功效，用于治疗各种癌症和胃脘痛症[3]。目前研究证实其具有良好的增强免疫系统活性[4]、减轻细胞氧化应激[5]、组织修复[6]、抑制癌细胞生长[7-10]等作用。随着北青龙衣抗肿瘤作用的证实，其毒性问题也受到重视。研究证实其毒性成分主要分布于脂溶性部位，如醇提物、乙酸乙酯萃取物等[11-13]，多为胡桃醌(5-羟基-1,4-萘醌)等萘醌类成分。该部位成分展现出良好的抗肿瘤活性但也暴露出较强的神经毒性及刺激性[14-16]。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术探究北青龙衣在大鼠心肌组织中的成分分布，为进一步揭示其成分分布特点、进一步进行毒性研究奠定物质基础。

1 材料

1.1 实验动物 10周龄SPF级Wistar大鼠，雄性，体质量270～300 g，由北京通利华实验动物技术公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验动物饲养于室温(23±2)℃、湿度(60±10)%鼠房，12 h昼夜循环光照、大鼠可自由饮水及进食普通饲料。

1.2 实验药物和试剂 北青龙衣于2016年6 月采自哈尔滨市方正县(128°92′62.1″E，45°62′82.8″N)，经王伟明研究员鉴定为胡桃属植物核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)的果实。将果实外表皮置于通风处阴干，作为供试药物。甲醇、乙腈：色谱级，德国默克；甲酸：色谱级，美国赛默飞；蒸馏水：广州屈臣氏。

1.3 实验仪器 AB UPLC型超高压液相色谱、AB 5600+型高分辨质谱仪：CIEX，美国；CM-12J型氮气吹干机：成萌伟业，中国北京；DW-86L959型冰箱：海尔，中国山东青岛；Legend Micro 17R型低温高速离心机：赛默飞世尔，美国；BP211D型电子天平：赛多利斯，德国。软件Analyst TF 1.7.1、PeakView 2.0、masterview1.0、Metabolitepilot1.5：SCIEX，美国。

2 方法

2.1 样品溶液的制备 提取物制备：取原药350 g，75%乙醇2 800 mL超声提取2次，每次60 min，2次提取液合并后旋蒸至密度1.30，减压干燥即得。灌胃药液的制备：参考药材标准拟定北青龙衣单日服用剂量为30 g[2]，按照70 kg成人10倍量进行换算，将乙醇提取物配制成1.35 g/mL溶液备用。

2.2 心肌组织制备 实验动物随机分成空白、给药两组，自由饮水，禁食12 h。空白组称重后以20 mL/kg灌胃蒸馏水，给药组同法灌给2.1制备的药液。给药后0.5 h，麻醉大鼠并采集心脏，置于-80 ℃冰箱备用。剪取200 mg大鼠心肌组织于EP管内，取双蒸水1 000 μL匀浆，加入4倍量乙腈，2 500 r涡旋60 s，低温超声120 s后4 ℃静置10 min，精密转移上清液2 000 μL，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，定量取上清液1 200μL，氮吹干后以80%甲醇250μL复溶，2 500 r涡旋60 s，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取上清进样。

2.3 色谱条件 Acquity UPLC BEH系列色谱柱，BEH C18预柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，(美国Waters)，流速0.3 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

2.4 质谱条件 使用Analyst TF 1.7.1 进行数据的采集。以电喷雾电离源、N2作为雾化气，采用正、负离子扫描方式，对响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，开启扣除背景(DBS)。质谱条件见表2。

表2 质谱条件表

2.5 数据分析方法 原型成分：数据导入Peakview2. 0内嵌软件Masterview中，Confidence setting(信任设定)为Mass Errorr<5；权重30%，Isotope<10%；权重40%，Formula Finderscore>70%；权重40%，选择RT Error%for RT Score。排除共有成分，结合保留时间、精确质量数、误差值以及碎片离子对数据综合研判。代谢产物：利用MetabolitePilot1.5，将体外数据库化合物的化学结构式以及二级图谱导入；依据代谢参数、选择最高概率会发生的两条代谢路径，选择Peak Finding Strategy、Generic Parameters、Compound-Specific Parameters；导入两组数据并分为“sample”和“model”，综合分析推断得到代谢产物。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS的采集 利用2.3及2.4项下已建立色谱质谱条件对样品进行数据采集，结果见图1。

图1 正、负离子模式下的总离子流色谱图(A: ESI+；B：ESI-)

3.2 心肌组织北青龙衣成分分布 对采集的数据进行分析，鉴别得到31个化合物，包括原型成分22个和代谢产物9个，其中萘醌类化合物18个，二芳基庚烷类7个，三萜类3个，黄酮类化合物2个以及酚酸类1个。结果见表3。

北青龙衣代表性化合物为萘醌类，其质谱裂解一般遵循H2O和CO的接连丢失。以所鉴别的13号化合物胡桃醌裂解途径为例，准分子离子175[M+H]+丰度高，易丢失一个H2O形成157[M+H-H2O]+碎片离子，随后的高能碰撞造成CO的连续丢失，129[M+H-H2O-CO]+、101[M+H-H2O-2CO]+相继出现。而与此同时，准分子离子也会在离子源的轰击下首先失去CO碎片致使147[M+H-CO]+离子形成，接连的CO丢失诱使开环反应出现133[M+H-CO-CH2]+、121[M+H-CO-C2H2]+两个碎片离子出现。并且通过与胡桃醌对照品的二级图谱进行比较，综合判断13为胡桃醌，通过结合二级碎片离子预测可能裂解形式，见图2、图3。

图2 化合物13二级质谱图及对照品比对镜像图

图3 化合物1结构解析图

表3 大鼠心肌组织北青龙衣成分分布

续表3 大鼠心肌组织北青龙衣成分分布

续表3 大鼠心肌组织北青龙衣成分分布

4 讨论

首先，本课题组对1、5、10倍临床剂量对北青龙衣成分的检出进行探究，发现10倍给药量的心肌组织响应强度大且离子数最多。因此选定10倍给药量为考察剂量。其次，对时间节点进行了考察，通过对0.5、1、2、3、4 h 5个节点心肌成分谱图丰度以及离子强度的研究，最终采用效果最理想的0.5 h作为时间节点。再次，通过4倍量甲醇、乙腈、甲醇：乙腈(1∶1)及乙酸乙酯对去除组织蛋白试剂考察，发现去除杂质较好的为乙腈，检测到的成分多、峰强大，故而确定乙腈法为样本预处理方法，确定响应值较大与离子数最多的乙腈法做为处理方法。

通过一系列的研究，自大鼠心脏组织中共鉴定出萘醌18个，二芳基庚烷7个，2个黄酮类，三萜3个以及1个酚酸，共计22个原型成分和9个代谢产物在内的31种成分。基本可以判断北青龙衣的萘醌类、二芳基庚烷类为主要的入心脏成分，为下一步其对心脏毒性的研究提供物质基础，丰富了北青龙衣的基础研究。