HPLC法测定磷酸替米考星可溶性粉中有关物质的研究

马春芳，李 敏，吴春燕，张 雯，邓亚婷，陈建蓉，王 旗，余永涛，杨 奇*

(1.宁夏兽药饲料监察所，宁夏银川 750011；2.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

磷酸替米考星可溶性粉是替米考星原料药与磷酸溶液发生成盐反应与无水葡萄糖或乳糖等混合后制成可溶性粉制剂，为国家三类新兽药，属大环内酯类类畜禽专用广谱抗生素[1]，对革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌及支原体等有很强的抑菌作用[2-3]，主要用于治疗敏感性细菌引起的消化道、呼吸道疾病[4-5]。其克服了替米考星不溶于水、生物利用度低、不方便临床用药等问题，是安全有效治疗家畜呼吸系统疾病的一类兽药。目前，关于磷酸替米考星可溶性粉药动学与药效学[6]的报道较多，冷晓红等[7]就磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量做了研究，针对其有关物质测定的研究尚无报道，仅农业部2172号[8]、2270号[9]、2440号[10]、2455号[11]公告对磷酸替米考星可溶性粉的质量标准及其检测方法作了规定，4个公告中有关物质检测方法中供试品处理方法、梯度洗脱比例，规定的单个杂质及各杂质和的限度均不同，为实际检测工作带来不便，所以有必要建立一套专属性强，重复性好的有关物质检查法，有效控制磷酸替米考星可溶性粉的质量。

本研究根据农业行业(国家)标准项目兽药国家标准制修订的要求，并参考《中国兽药典》[12]中替米考星原料药的杂质限度要求(其杂质均为未知杂质)，针对磷酸替米考星可溶性粉有关物质检测方法进行修订完善，研究了磷酸替米考星可溶性粉中有关物质测定的HPLC法，并对其进行方法学验证和系统适用性研究，提出系统适用性要求，建立专属性强、准确灵敏的检测方法，使其能够满足国家质量检测标准的相关要求和实际检测工作的需求，能够应用于磷酸替米考星可溶性粉的质量控制。本研究将为确保兽药产品质量安全，提高质量标准检测的稳定性和可靠性，进一步完善国家兽药质量标准体系提供重要的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 替米考星标准品(含量95.3%，批号K0311805)，中国兽医药品监察所产品；磷酸替米考星可溶性粉(批号1803001、1803002、1803003，规格均为10%)，山东鲁抗舍里乐药业有限公司高新区分公司产品；磷酸替米考星可溶性粉(批号20180101、20180102、20180103，规格均为10%)，广东温氏大华农生物科技有限公司保健品厂产品；磷酸替米考星可溶性粉(批号F83190503，规格为10%)，宁夏泰瑞制药股份有限公司产品；磷酸替米考星可溶性粉(批号18012301、18012302、1802303，规格均为10%)，河北维尔利动物药业集团有限公司产品。

乙腈(色谱级，批号172290)，Fishow chemical公司产品；磷酸(优级纯，批号20170216)，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；四氢呋喃(色谱级，批号20180206)，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；正二丁胺(化学纯，批号20180303)，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 Agilent1100、Agilent1260 Ⅱ高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品；电子天平(十万分之一)、F28-pH计，德国梅特勒-托利多公司产品；KQ-250B型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；ZB8/AKF-3水分测定仪，瑞士万通公司产品；DZF-6090减压干燥箱，上海旌派科技有限公司产品；Direct-Q 8超纯水仪，德国默克密理博公司产品。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，边加边搅拌，冷却后，用磷酸调节pH至2.5±0.1，加水至100 mL)(975∶25)为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱(表1)；检测波长为280 nm，流速为1.1 mL/min。

表1 梯度洗脱比例

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 标准品溶液的制备 取替米考星标准品适量，精密称定，加乙腈定量稀释配制成每1 mL中含0.25 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取磷酸替米考星可溶性粉适量(约相当于替米考星0.2 g)，精密称定，置50 mL量瓶中，加磷酸溶液适量，加乙腈10 mL，超声使溶解，并用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为有关物质测定的供试品溶液。

1.2.2.3 系统适用性 精密量取替米考星标准品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图。

1.2.2.4 方法精密度 精密称取2.000 g磷酸替米考星可溶性粉 6份，置50 mL容量瓶中，加磷酸稀释液适量，加乙腈10 mL，超声使溶解，再用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取各溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.2.5 专属性考察

(1)干扰试验 分别取溶剂空白、辅料空白(0.05 mol/L磷酸、葡萄糖、乳糖)、供试品和替米考星对照品，按有关测定项下方法进行测定。

(2)破坏性试验 取磷酸替米考星可溶性粉作供试品进行破坏性试验，经过高温、强光、酸度、碱度、氧化等破坏，检测有关物质是否发生变化、降解。称取5份磷酸替米考星可溶性粉2.000 g，同时称辅料空白，分别做105℃高温破坏、4 000 lx强光破坏、1 mol/L盐酸溶液强酸性破坏、1 mol/L氢氧化钠溶液强碱性破坏、加入30 mL/L过氧化氢溶液1 mL做氧化破坏试验，按照供试品溶液配制的方法，将破坏过的磷酸替米考星可溶性粉进行样品前处理，精密量取10 μL注入高效液相色谱仪，进样分析，记录杂质变化。

1.2.2.6 检测限 配制不同浓度的替米考星对照品溶液，浓度为0.04、0.05、0.06 mg/mL，以信噪比约为3∶1时的浓度为检测限。

1.2.2.7 溶液稳定性 将配置的有关物质的供试品溶液分别放置0、4、6、10、16、24、36 h后进样测定有关物质杂质峰面积变化。

1.2.2.8 耐用性 通过改变柱温、流速以及不同品牌的色谱柱对色谱条件进行微调，检测磷酸替米考星可溶性粉在不同色谱条件下有关物质检测结果变化，考察其方法的可行性。

2 结果

2.1 系统适用性结果

由表2可知，有关物质测定的理论塔板数最大为30 467，最小为28 221；反式异构体保留时间均在9.5 min，顺式异构体保留时间为10.1 min，峰面积的含量均在范围内，峰面积RSD均小于2.0%，保留时间RSD均小于1.0%；替米考星反式异构体峰、顺式异构体峰与顺-8-差向异构体的相对保留时间分别为0.9、1.0、1.1 min。

表2 有关物质系统适用性试验结果

2.2 方法学验证结果

2.2.1 方法精密度结果 有关物质方法精密度结果见表3。单个杂质平均为1.25%，各杂质的和平均值为5.65%，符合兽药典中规定的样品待测成分为1%～10%范围要求，RSD可接受范围为3.5%，计算6次测试的磷酸替米考星可溶性粉中单个杂质和各杂质的和的相对标准偏差分别为1.33%和0.51%。

表3 方法精密度结果

2.2.2 干扰试验 专属性试验结果如图1～图6所示。溶剂空白、辅料空白对磷酸替米考星可溶性粉有关物质色谱峰均无干扰，有关物质色谱峰显示供试品反式异构体的两个不完全分离的峰保留时间与标准品保留时间一致，相对标准偏差0.05 %；供试品色谱图中分离的主峰和已知杂质与潜在杂质的可接受标准为主峰与各杂质峰之间分离度大于1.5 。

图1 溶剂空白-乙腈+磷酸溶液色谱图

2.2.3 破坏性试验结果 破坏性试验结果见表4，由表4可知，在强酸、强碱、氧化、高温等剧烈条件下，对供试品进行破坏。溶剂空白、辅料空白未产生明显的降解产物，且不干扰有关物质检测。供试品对光照、高温、氧化等条件变化测定的结果比较稳定，单个杂质与各杂质的和均在3.0%和9.0%限度范围内，有关物质未发生明显变化。

图2 辅料空白-磷酸溶液色谱图

图3 辅料-乳糖色谱图

图4 辅料-葡萄糖色谱图

图5 对照品色谱图

图6 供试品色谱图

表4 有关物质破坏性试验结果

2.2.4 定量限与检出限 按照有关物质项下方法，配制浓度为0.04、0.05、0.06 mg/mL的替米考星标准品溶液，以信噪比约为3∶1时的浓度测得有关物质的检测限，为0.1 μg/mL，信噪比10∶1时的浓度定量限为0.4 μg/mL。

2.2.5 稳定性试验结果 有关物质供试品溶液稳定性试验结果。磷酸替米考星可溶性粉溶液在24 h内稳定，杂质峰面积未发生明显变化，RSD为1.2%，小于2.0%；24 h～36 h色谱峰面积增大，峰型增宽，杂质峰增多，溶液不稳定，RSD大于2.0%。

2.2.6 耐用性试验结果 如表5结果显示，采用岛津Intertsustain C18色谱柱时，替米考星反式异构体未能出现两个不完全分离的峰，分离度达不到要求。使用Aiglent ZORBA*SB C18150*4.6 mm 5 μm色谱柱时，有关物质测定梯度洗脱时间较长，该色谱柱较短，不能满足梯度洗脱比例变化要求，不出现色谱峰。采用Waters C18 5 μm 250*4.6 mm柱或Aiglent C18 250*4.6 mm柱时，分离度分别为2.45和2.32；柱温在20、25、30℃检测有关物质的结果均一致；流速进行微调测定无明显变化，理论塔板数按顺式替米考星计算均不低于3 000，分离度均大于1.5，表明方法耐用性良好。

表5 有关物质耐用性试验结果

2.3 样品测定

拟定方法下测得4家企业11批样品，其单个杂质均小于3.0%；样品各杂质的和均小于9.0%，符合规定(表6)。

表6 有关物质测定杂质检测结果

3 讨论

农业部4个公告中流动相组成一致，均以水-磷酸二丁胺溶液=975∶25为流动相A；以乙腈为流动相B，但梯度洗脱的比例不一致，2172、2455号公告的流动相比例下样品中替米考星反式异构体两个不完全分开的峰不明显；2270、2440号公告流动相比例下，替米考星反式异构体两个不完全分开的峰明显出现，但2440号公告主峰保留时间与2270号公告相比，有所推迟；本研究选择与《中国兽药典》2015版中替米考星有关物质测定项下的洗脱比例，替米考星反式异构体两个不完全分开的峰明显出现。

有关物质耐用性试验结果表明，使用Aiglent ZORBA*SB C18250*4.6 mm色谱柱和Waters symmetry@ C18 250*4.6 mm色谱柱，反式异构体均出现两个不完全分离的2个峰。测得替米考星反式异构体和顺式异构体峰的分离度分别为2.41和2.45，分离度符合要求。所以在对磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有关物质测定时，建议最好选用Aiglent 或WatersC18 250*4.6 mm色谱柱。

本研究通过对磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有关物质测定的高效液相色谱方法的系统适应性研究，有关物质检测并与《中国兽药典》(2015版)和农业部4个公告对比，显示在该色谱条件下，对样品进行破坏检测均无干扰，方法专属性强；测定的样品相邻色谱峰之间的分离度高，对磷酸替米考星可溶性粉高效液相色谱检测方法的色谱条件进行微调，测定结果一致，方法耐用性强。本法可用于对磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有关物质的限度测定。