亚急性乌头碱中毒小鼠的病理组织学变化

李 博，张 雨，朱燕丽，孙 璐，黄恩霞，莫重辉，路 浩*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016)

乌头属(AconitumL)是一类兼具药用价值和极强毒性的毛茛科(Ranunculaceae)一年至多年生草本植物。广布于北半球温带地区，主要分布于亚洲、欧洲、北美洲，其中亚洲分布最广，尤以我国物种资源最为丰富，主要分布于四川、云南、西藏等西南省区。乌头属种类繁多，全球约有350种，我国有200多种，约76种可供药用[1-2]，例如白喉乌头、草乌、川乌、北乌头、黄花乌头、铁棒锤等。随着气候变化、过度放牧、不合理开发等自然和人为因素的影响，草地严重退化，乌头等毒草迅速大量滋生繁衍，导致优质牧草的产量进一步降低，加重了草原荒漠化，加大了放牧动物毒草中毒的概率[3]。乌头被各种家畜误食后均可引起中毒，表现流涎、呕吐、腹痛、腹泻，瞳孔散大、呼吸困难、运动中枢和感觉麻痹等特征，最终因心脏麻痹和呼吸衰竭而死亡[4]，可对草原畜牧业造成较大经济损失。

目前，有关乌头的研究主要集中在强心[5]、镇痛[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]、抗衰老[9]及抗病毒[10]等药理作用方面，而对其毒理作用方面研究相对较少。已有研究表明，乌头属植物含有90多种生物碱[11]，主要有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等，其中以乌头碱(aconitine)毒性最强，为二萜类生物碱，是乌头的主要毒性成分[12]。国内外学者有关乌头碱的研究主要集中在乌头碱的神经毒性和心脏毒性方面。Zhao Y等[13]发现乌头碱能够显著触发多巴胺释放、通过氧化应激损伤PC12细胞发挥神经毒性。Peng C等[14]从SD大鼠体内获得皮质神经元细胞并进一步研究表明，乌头碱对大脑具有明显神经毒性作用，其机制可能是通过抑制Na+-K+-ATP的活性从而导致细胞损伤，造成大脑形态和功能的破坏。Sandeep T等[15]报道了人乌头中毒导致心律不齐和心室震颤的病例。张硕峰等[16]通过动态观察乌头碱的心脏毒性与强心作用发现，中毒量的乌头碱能够导致心率减慢、心室震颤，最终死亡，具有明显的心脏毒性。Gao X T等[17]研究了乌头碱在H9c2心肌细胞凋亡中的作用，揭示了乌头碱通过介导线粒体通路诱导心肌细胞凋亡。

截至目前，有关乌头碱中毒模型研究较少[18-19]，且其在小鼠产生的病理组织学变化尚不清楚。鉴于此，本研究拟通过复制小鼠乌头碱亚急性中毒试验模型，探讨亚急性乌头碱中毒对小鼠病理组织学变化的影响，为乌头碱毒性作用机制研究及动物乌头中毒病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 7日龄健康昆明小鼠120只，购自成都达硕实验动物有限公司。饲养温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%，12 h～12 h昼夜交替。饲养期间给予充足的全价鼠粮和饮水。

1.1.2 主要试剂及仪器 98.86%乌头碱，成都曼思特公司产品；甲醛等有机溶剂均为国产分析纯，四川西陇化工有限公司产品；BL6100电子天平，德国Sartorius公司产品；精密转轮切片机，美国AO公司产品；荧光正置显微镜，日本尼康公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠亚急性乌头碱中毒模型的复制 将小鼠适应性饲养7 d后随机分为对照组(生理盐水组)、低剂量组0.14 μmol/L、中剂量组0.28 μmol/L、高剂量组0.56 μmol/L，每组30只。连续灌胃30 d。

1.2.2 临床症状观察 每天观察并记录各组小鼠的饮食状况、精神状态、行为活动及临床表现等。

1.2.3 病理组织切片制作及染色观察 攻毒30 d时，将心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、大脑、小脑固定于100 mg/mL甲醛溶液中24 h以上。冲洗组织，随后修剪成3 mm～5 mm的组织块，注意脑组织作横切。然后依次在700、800、850、900、950 mL/L、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中分别进行脱水处理50 min。在无水乙醇脱水后，置于无水乙醇与二甲苯混合液中30 min，再依次入纯二甲苯Ⅰ、纯二甲苯Ⅱ各10 min，置换出脱水剂并使组织呈半透明状态。组织透明后，入熔化的石蜡内浸蜡2 h后用包埋专用框进行组织包埋。将蜡块固定在切片机上进行切片，单张切片的厚度为3 μm～5 μm，并进行展片处理后进行染色。在染色缸内依次进行脱蜡(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min)、脱苯(无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、950、900、800、700 mL/L乙醇各1 min)、水洗1 min、染苏木精1 min后自来水冲洗两次2 min～3 min，10 mL/L盐酸乙醇中分化30 s后，浸入常水2 min～3 min。10 mg/mL伊红染色2 min～3 min，加入蒸馏水快洗3 s～5 s。染色结束后，再进行一次脱水、透明处理，最后在组织切片上滴加1滴～2滴中性树胶封片剂。

切片制备完成后，利用荧光正置显微镜(10×20倍)，观察主要脏器的病理组织学变化。

2 结果

2.1 临床表现

对照组小鼠试验中未见明显异常。灌胃第3天，低剂量组未见明显异常，中剂量组及高剂量组均有小鼠出现精神沉郁、发汗，高剂量组还表现出轻度的皮肤震颤及腹泻现象。灌胃第5天，高剂量组有小鼠出现呕吐。灌胃第6天，低剂量组和中剂量组排带有黏液的软便。灌胃第15天，高剂量组部分小鼠表现行走不稳、步态左右摇晃等神经症状。灌胃第20天，高剂量组小鼠除眼睑水肿，尾部体温偏低，口鼻、尾部及四肢皮肤发黑外，还出现头颈及四肢震颤，共济失调，盲目运动等明显神经症状，且伴有间歇性躁动不安。

2.2 病理组织学变化

2.2.1 脑病理组织学变化

2.2.1.1 大脑 对照组大脑结构清晰，无明显变化(图1A)。低剂量组大脑间质无明显变化(图1B)。中剂量组病理变化可见部分神经细胞水肿，有轻微噬神经现象(图1C)。高剂量组大脑中部分皮质细胞肿胀、变性、坏死，有明显的噬神经现象。间质结构松散，血管扩张，充满红细胞(图1D)。

2.2.1.2 小脑 对照组小脑皮质结构正常，细胞微细结构无肉眼可见病理变化(图1E)。低、中剂量组可见浦肯野细胞出现轻微空泡变性(图1F,G)。高剂量组小脑浦肯野细胞肿胀、变性、坏死，胞浆内有数量不等的空泡，细胞空泡化严重(图1H)。

2.2.2 心脏和肺脏的病理组织学变化

2.2.2.1 心脏 对照组心肌纤维排列规则、整齐，间质无明显病理变化(图2A)。低剂量组未见明显心肌断裂、变性(图2B)。中、高剂量组可见心肌纤维肿胀、坏死、断裂，呈凝固性坏死。间质静脉血管充血，结缔组织细胞增生(图2C和图2D)。

2.2.2.2 肺脏 对照组肺脏各级小管无明显病理变化(图2E)。低剂量组小鼠肺脏轻微淤血，肺脏各级小管比较正常(图2F)。中剂量组少数肺泡壁增厚，充血、出血现象较高剂量组轻微，未见上皮脱落(图2G)。高剂量组可见肺泡壁增厚，肺泡壁相互融合形成腔体，肺泡腔内可见炎性细胞浸润。肺间质毛细血管扩张充血，有出血现象，细支气管上皮有细胞脱落现象(图2H)。

2.2.3 肝脏、脾脏和肾脏病理组织学变化

2.2.3.1 肝脏 对照组肝细胞索排列整齐，汇管区结构正常(图3A)。低剂量组中央静脉轻微充血，肝细胞质少量空泡化(图3B)。中剂量组中央静脉充血，肝细胞索凌乱，肝窦隙内有大量枯否氏细胞。部分肝细胞肿胀，出现颗粒变性、坏死，肝细胞质空泡化(图3C)。高剂量组汇管区有血管效应，肝细胞索凌乱，肝窦隙扩张，充满红细胞。肝细胞广泛性肿胀，出现颗粒变性、坏死，肝细胞质出现空泡化(图3D)。

2.2.3.2 脾脏 对照组脾组织结构致密，无明显病理学变化(图3E)。低剂量组有轻微病变，可见少量巨核细胞(图3F)。中剂量组病变较高剂量组轻微，巨核细胞明显多于高剂量组(图3G)。高剂量组脾脏白髓萎缩，脾血窦扩张、充满红细胞，脾脏可见大量巨核细胞；淋巴细胞数量增多，部分淋巴细胞变性深染、核浓缩(图3H)。

A～D.依次为对照组、低剂量组(轻微水肿)、中剂量组(轻微噬神经现象)和高剂量组大脑(部分皮质细胞肿胀、变性、坏死)；E～H.依次为对照组、低剂量组(轻微神经细胞损伤)、中剂量组(血管套现象)和高剂量组小脑(明显噬神经现象)

2.2.3.3 肾脏 对照组肾小球、肾小管结构正常，间质组织致密(图3I)。低剂量组肾脏肾小球、肾小管均无明显变化，但肾间质严重充血、出血(图3J)。中剂量组肾小球无明显病变，肾小管上皮细胞胞浆浑浊、颗粒变性、胞核即将消失，肾小管远曲小管、近端小管管腔上皮有脱落并有渗出物，间质充血、出血现象减轻(图3K)。高剂量组肾脏中有的肾小球肿胀或固缩，肾小管病变与中剂量组一致。肾小管间质充血、出血明显，尚存的肾小管内有管型(图3L)。

A～D.依次为对照组、低剂量组、中剂量组(心肌纤维肿胀)和高剂量组心脏(心肌纤维断裂)；E～H.依次为对照组、低剂量组(轻微淤血)、中剂量组(肺泡壁增厚)和高剂量组肺脏(炎性细胞浸润)

A～D.依次为对照组、低剂量组(轻微空泡化)、中剂量组(肝细胞索肿胀变性)和高剂量组肝脏(广泛空泡化)；E～H.依次为对照组、低剂量组(轻微出血)、中剂量组(巨核细胞增加)和高剂量组脾脏(严重出血)；I～L.依次为对照组、低剂量组(轻微肿胀)、中剂量组(颗粒变性)和高剂量组肾脏(管型尿)

3 讨论

有资料表明，乌头碱主要表现为心脏毒性，可通过抑制心肌细胞膜上调节离子转运相关ATP酶活性、电压门控Na+离子通道开放导致心肌细胞内钙超载和离子水平紊乱，或者通过兴奋迷走神经释放的乙酰胆碱直接抑制房室结或兴奋异位起搏点，进而引起心律失常[20-21]，还可破坏线粒体等细胞器及心肌细胞膜，引起心肌细胞死亡，乙酰胆碱释放增加可引起大量NO产生，导致血管内皮细胞凋亡[22]，造成心脏组织损伤，小鼠表现口鼻、尾尖及四肢末端发黑，尾尖发凉等循环系统症状。

此外，乌头碱在体内可通过胃肠道及肝脏代谢[23]，相应的代谢产物可在这些器官被吸收通过肾脏随尿液排出[24]，心脏受损引起的缺血、缺氧加上乌头碱及其代谢产物的毒性作用，使小鼠消化系统及泌尿系统器官受损。乌头碱还可通过影响神经细胞离子通道、神经递质浓度及神经细胞能量代谢，诱导神经细胞凋亡[25]，影响P-糖蛋白表达[26]等机制对中枢神经产生毒性作用。本试验中各攻毒组小鼠均不同程度表现中毒症状，尤其是高剂量组小鼠表现大量出汗、腹泻、呕吐，并伴有明显的神经症状。

在兽医临床上，由于动物疾病种类繁多，发病原因及发病机制复杂，除临床症状观察外，对组织器官进行病理学检查有助于动物疾病的诊断，此外，病理组织学变化也是药物毒性对机体可能产生损伤的重要依据[27]。刘刚等[28]对兔进行灌胃染毒制备急性草乌中毒模型并采集心室肌、肝脏、大脑皮质，光镜下观察组织病理学变化，结果发现大脑皮质细胞水肿明显，细胞微细结构消失；心室肌细胞水肿，血管充血；肝脏组织可见汇管区血管效应及大量淋巴细胞浸润。Ji B L等[29]在研究乌头碱对人胰腺癌细胞生长和凋亡的影响时，对肿瘤组织进行HE染色并观察发现，乌头碱能抑制胰腺肿瘤组织的生长，且乌头碱浓度越高，肿瘤生长受抑制越明显。Prasanta P K等[30]在用硼砂处理乌头碱进行减毒研究中对乌头碱攻毒组大鼠多种组织器官进行病理组织学观察发现，肺泡结构破坏且有严重出血，睾丸中精子发生急剧减少，子宫上皮细胞脱落。本试验结果与前人报道基本一致，同时高剂量组小鼠主要脏器均发生不同程度的变性、坏死，间质组织充血、出血等病理学变化，相比病变更为严重，这可能与试验动物品种、攻毒浓度不同等有关。值得一提的是，本试验中中剂量组脾脏中巨核细胞明显多于高剂量组，表明中剂量乌头碱可激活并增强小鼠机体免疫功能，而高剂量组则呈现明显免疫抑制作用。

本试验探讨了亚急性乌头碱中毒对小鼠主要脏器的病理组织学变化的影响，结果表明不同浓度乌头碱对小鼠各组织脏器具有明显毒性作用，其中以心脏和神经毒性损伤最为明显。本试验结果可为后续乌头碱毒性作用机制研究及动物乌头中毒病防治提供理论依据。