猫杯状病毒分离鉴定及其VP1基因序列分析

王 洁，丁航天，廖均乐，钱 鹏，刘玉秀,3，习向锋，张许科,3*，田克恭,3*

(1.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450002；2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471000；3.普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471000)

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是引起猫呼吸系统疾病的主要病原之一。FCV是属杯状病毒科(Caliciviridae)水疱疹病毒属(Vesivirus)的无囊膜单股正链不分节段RNA病毒[1]，病毒粒子直径为35 nm～39 nm，核衣壳呈20面体对称。FCV基因组大小约7.7 kb，包含3个开放性阅读框(open reading frames,ORFs)。ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码结构蛋白VP1[2]，包括A～F 6个区域，A区高度保守，含有一段FCV共有序列，在衣壳蛋白VP1成熟过程中被裂解掉；B、D和F区相对比较保守；E区包含主要的B细胞表位[3]，其变异性是基于序列区分分离株的基础。C和E区是高变区。E区分为3个区域，中心相对保守区域将5′端高变区和3′端高变区分隔开。E区的5′端高变区和C区参与病毒的中和作用，而它们的多变性是大部分FCV毒株相互间交叉保护低的原因。C、D和E区核苷酸的改变会影响FCV的反应原性。

FCV复制过程中RNA依赖RNA聚合酶转录过程缺乏校对和低保真性，这种容易出错的复制机制为FCV提供高度基因可塑性和适应性[4]。该病毒在免疫压力下容易产生变异以更快适应新环境生态位，导致FCV核苷酸进化树呈现“星状”系统发育。早期的FCV流行株感染猫症状为眼鼻分泌物增多、发热、口腔溃疡、鼻塞等一系列上呼吸道症状，随着疫苗使用和环境压力，FCV突变出可引起肺炎下呼吸道症状、跛行、胃肠道症状等毒株。2000年前后出现的高致病性FCV(virulent-systemic feline caliciviruses,VS-FCV)会引起全身性皮肤溃疡、黄疸、肝炎等不同于经典FCV的强毒力系统性疾病[5]，病死率高达67%，有免疫史的猫对VS-FCV仍易感，国内已有VS-FCV的相关报道[6]。FCV部分感染猫康复后仍会继续排毒，持续时间为30 d至数年不等[7]。有报道显示，2005年欧洲FCV横向流调感染率为20%～40%，FCV纵向流调结果显示感染率为30%～75%[8-9]。目前国内FCV的预防主要依赖于进口猫三联疫苗。

本研究在2019年1月～3月从天津、北京两地采集患病猫眼、鼻、肛拭子，利用F81细胞分离鉴定得到5株FCV，并对其进行VP1基因测序分析，与疫苗株及国内外流行毒株进行同源性比对，以期了解天津和北京地区FCV分子流行病学特点和病毒遗传变异情况，为FCV流行动态追踪和诊断及预防提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料与细胞 2019年1月～3月，从天津、北京4家宠物医院采集猫眼、鼻、肛拭子，采样过程不区分患病猫是否有上呼吸道症状，加入1 mL PBS(pH 7.0)，涡旋混匀，置-80℃冰箱备用。F81细胞，由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒，Geneaid公司产品；反转录试剂盒和pEasy-Blunt载体，北京全式金生物技术有限公司产品；胶回收试剂盒，TIANGENA公司产品；DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 5 000、PrimeSTAR Max Premix DNA，宝生物工程(大连)有限公司产品；鼠抗FCV单抗为洛阳普泰生物技术有限公司惠赠；FITC标记羊抗鼠IgG，Sigma公司产品；RPMI 1640培养基、胰酶，美国Gibco公司产品；胎牛血清，德国Cegrogen公司产品。

1.1.3 仪器设备 涡旋振荡仪(VOKTEX-5)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；离心机(minispin plus)，Eppendorf公司产品；生物安全柜(NU-543-400S)、二氧化碳培养箱(CCL-170B-8)，ESCO公司产品；恒温水浴锅(HS-4)，华利达实验设备有限公司产品；超低温冰柜(MDF-86V50)，中科都菱商用电器股份有限公司产品；PCR仪(C1000 Touch)、紫外凝胶成像仪(GelDoc XR+)、电泳仪(PowerPac)，Bio-Rad公司产品；倒置荧光显微镜(Nikon Ts2)，Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料PCR检测 参照文献[10]合成FCV、猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus type 1,FHV-1)和猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)的特异型性鉴定引物，引物序列见表1，由金唯智生物科技有限公司合成。参照商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书对处理后样品进行病毒核酸提取，利用表1的鉴定引物进行PCR或RT-PCR扩增，PCR产物采用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表1 引物序列信息

1.2.2 FCV的分离培养与纯净性检验 将眼、鼻、肛拭子溶液漩涡混匀后，加入无血清RPMI 1640培养液至1 mL，4℃、5 000 r/min离心5 min，取上清经过0.22 μm滤膜过滤除菌，将滤液接种单层F81细胞，体积分数为5% CO2、37℃温箱中吸附1 h。弃上清，用无血清RPMI 1640培养液洗涤1次，补充含20 mL/L FBS的RPMI 1640培养液，在体积分数为5% CO2、37℃条件下培养。每12 h观察细胞状态，待出现变圆、皱缩、聚集成葡萄串状和脱落等细胞病变且病变达到80%～90%时收获细胞培养物，冻融1次后收至-80℃冰箱备用；若未出现细胞病变，盲传3代，期间出现上述细胞病变，则进行相同操作收毒，若无细胞病变，则视为未分离到病毒，弃去。对5株分离株进行FCV、FHV-1和FPV 3种病毒PCR检测。

1.2.3 分离毒株间接免疫荧光鉴定 将分离株接种单层F81细胞，设正常细胞对照，置体积分数为5% CO2、37℃温箱培养，待18 h～24 h后出现明显病变，弃接种液，PBS洗涤3遍；800 mL/L冷丙酮4℃固定20 min，PBS洗涤3遍；加入鼠抗FCV一抗，37℃孵育1 h，PBS洗涤3遍，加入FITC标记羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1 h，PBS洗涤3遍，置于倒置荧光显微镜下观察结果。

1.2.4 FCV温度抵抗力试验 F2019TJ1株FCV的P1代接种于F81细胞，置于体积分数为5% CO2、37℃温箱中培养18 h～24 h，待细胞病变达80%～90%以上冻融收毒P2代，分装为若干小样，分别置于4℃环境中静置1、2、3、4、5、6 d，25℃环境中静置2、4、6、8、10 h，37℃环境中静置1、2、3、4、5、6、7 h。按每孔约2×104个F81细胞(100 μL)铺于96孔细胞板中，将处理后的病毒培养物用无血清RPMI 1640培养液进行10倍连续稀释(10-1～10-10)，每个稀释度以每孔100 μL接种6孔F81细胞，设立正常细胞对照，置于体积分数为5% CO2、37℃温箱中培养72 h～96 h，每日观察细胞病变，记录病变孔数，根据Reed-Muench法计算病毒含量。

1.2.5 分离毒株VP1基因序列扩增与序列分析 病毒提取RNA后，按照商品化反转录试剂盒合成cDNA，根据GenBank数据库中已发表的FCV VP1基因全长序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物FCV-CXF:CCTACACTGTGATGTGTTCG和FCV-CXR:GCAGCTTTGTCCAATTCAAT。PCR反应体系为50 μL：2×Prime STAR Max Premix DNA Polymerase 25 μL，FCV-CXF(10 μmol/L)和FCV-CXR(10 μmol/L)各2 μL，cDNA 5 μL，加ddH2O 16 μL补至50 μL。反应条件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，共33个循环；72℃ 10 min。用商品化胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收产物克隆于pEASY-blunt载体后转化Trans 5α化学感受态中构建质粒，经菌落PCR鉴定选取5个阳性重组质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序。使用MegAlign对测序结果和NCBI上已发表的FCV VP1基因核酸序列进行同源性比对分析，使用MEGA7.0软件构建FCV VP1基因序列系统发育树，采用邻接法以Boot Strap值(1 000)进行可靠性分析。

2 结果

2.1 病料样品中的PCR检测结果

2019年1月～3月从北京、天津两地宠物医院共采集到297份猫病料，采样过程不区分患病猫是否有上呼吸道症状，病料样品分为眼鼻拭子和肛拭子。核酸检测结果显示FCV阳性率为15.49%(46/297)，FHV-1阳性率为30.98%(92/297)，FPV阳性率为30.64%(91/297)。本研究共调查宠物猫297例，检测结果见表2。其中年龄在1岁以下的猫FCV阳性率为19.57%，1岁及以上的猫FCV阳性率为11.54%；不同性别猫感染FCV差异不大，其阳性率均在14.35%左右；进口猫三联灭活疫苗的免疫率为55.37%，已免疫猫FCV阳性率(11.94%)低于未免疫猫阳性率(16.67%)；采集的眼鼻拭子中FCV检出率(15.83%)高于肛拭子的检出率(10.53%)。其中有5份症状背景信息明确病料用FCV特异性引物RT-PCR扩增出大小约为321 bp的条带(图1)，与预期FCV阳性片段条带大小保持一致，而FHV-1和FPV特异性引物PCR扩增结果为阴性。

表2 样品信息统计

M.DNA标准DL 2 000; 1.F2019TJ1; 2.F2019TJ2; 3.F2019TJ3; 4.F2019BJ1; 5.F2019BJ2; 6.阳性对照; 7.阴性对照

2.2 FCV分离培养与纯净性检测

将RT-PCR鉴定结果为FCV单纯感染的5份猫眼鼻拭子接种于F81细胞，12 h～16 h后细胞出现变圆、皱缩、聚集成葡萄串状等细胞病变(图2)，28 h后细胞病变达80%及以上，而正常细胞未出现细胞病变。5株分离株FCV核酸检测结果均为阳性，FHV-1和FPV PCR检测结果均为阴性，表明分离的5株病毒纯净性良好。

A.F2019TJ1; B.F2019TJ2; C.F2019TJ3; D.F2019BJ1; E.F2019BJ2; F.正常F81细胞A.F2019TJ1; B.F2019TJ2; C.F2019TJ3; D.F2019BJ1; E.F2019BJ2; F.Normal F81cells

2.3 分离毒株的间接免疫荧光鉴定

以鼠抗FCV单抗为一抗，FITC标记羊抗鼠IgG为荧光二抗，对5株FCV分离株进行间接免疫荧光鉴定(indirect immunofluorescence,IFA)，结果显示，空白对照组未见绿色荧光，5株分离株接种的F81细胞均出现特异性绿色荧光(图3)，结果表明5株分离株均为FCV，将其分别命名为F2019TJ1株、F2019TJ2株、F2019TJ3株、F2019BJ1株和F2019BJ2株。

A.F2019TJ1; B.F2019TJ2; C.F2019TJ3; D.F2019BJ1; E.F2019BJ2; F.正常F81细胞A.F2019TJ1; B.F2019TJ2; C.F2019TJ3; D.F2019BJ1; E.F2019BJ2; F.Normal F81cells

2.4 分离毒株病毒温度抵抗力试验结果

F2019TJ1株进行病毒温度抵抗力试验见图4。结果显示，分离株于4、25、37℃静置一段时间后，病毒含量出现不同程度的下降。其中4℃环境下分离株病毒含量下降最慢，静置144 h从109.50TCID50/mL降至108.50TCID50/mL；37℃环境下分离株病毒含量下降最快，放置7h从109.50TCID50/mL降至107.50TCID50/mL。由此表明FCV对温度敏感。

A.4℃;B.25℃;C.37℃

2.5 分离毒株VP1基因序列扩增和遗传进化分析

将5株FCV VP1基因测序结果与已发表的疫苗株和国内外流行的FCV VP1基因序列进行同源性分析，构建基因系统进化树(图5)，结果显示5株FCV与国内外流行毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为73.4%～83.6%和80.1%～92.1%。其中5株FCV分离株中F2019BJ1株与F2019BJ2株属于同一分支，而F2019TJ1株、F2019TJ2株和F2019TJ3株则分散在参考毒株之间。F2019BJ1株、F2019BJ2株和F2019TJ1株与美国的UTCVM-H2株遗传距离最近，核苷酸和氨基酸同源性分别为76.4%～78.8%和84.2%～85.8%；F2019TJ2株和F2019TJ3株与国内的FCV-GD株遗传距离最近，核苷酸同源性分别为81.2%和83.6%，氨基酸同源性分别为88.2%和92.1%。

图5 不同FCV VP1基因核苷酸序列系统进化树

3 讨论

本研究是国内首次对京津两地同时进行FCV流行病学调查。2019年1月～3月京津两地患病猫眼鼻肛拭子中FCV、FHV-1和FPV阳性率分别为15.49%、30.98%、30.64%，与2018年广西南宁市[11]FCV阳性率(18.20%)差异不大，但2018年北京地区[12]FCV阳性率较高，为33.3%，其原因是样本来源为宠物医院上呼吸道感染的患猫。对不同年龄、不同性别猫数据进行比较发现，不同性别的猫对FCV易感度差异不大；不同年龄的猫均可感染FCV，小于1岁的猫对FCV更易感。这可能与年龄较小的猫免疫力较弱，在未接种疫苗的情况下，易受到上呼吸道病原的侵入有关。虽然宠物猫接种进口猫三联商品化疫苗已十分普遍，有研究发现已免疫FCV疫苗的猫场仍会暴发FCV，发病率达30%[13]。本试验数据显示已免疫的猫可感染FCV，而未免疫的猫更易感，说明目前进口猫三联商品化疫苗对天津、北京地区FCV流行毒株并不能产生完全的保护。在宠物医院观察发现，虽然FCV疫苗不能完全避免感染，但可以一定程度下减轻感染后的临床症状，因此疫苗的接种是十分必要的。目前已知FCV引起的临床症状为呼吸道症状、跛行和全身性症状，胃肠道症状一直被忽视，而杯状病毒科大多造成宿主胃肠道症状[14]。本次试验从部分患病猫肛拭子中检测到FCV核酸阳性，说明FCV可能通过肠道分泌物进行传播，对FCV的防控提出了更加严格的要求。

2015年，黄倩倩[15]研究发现，FCV在50℃静置30 min或70℃静置5 min即可灭活，但近期关于温度对FCV病毒滴度影响的报道较少。本研究对F2019TJ1株进行病毒温度抵抗力试验，结果显示，4、25、37℃条件下病毒滴度从109.5TCID50/mL下降到108.5TCID50/mL所需时间分别为144、9、4 h，其中37℃条件下病毒滴度下降最快，其次是25℃，最后是4℃。虽然FCV是一个无囊膜病毒，但其对热的抵抗力较弱。在环境温度处于30℃～50℃时，FCV表面蛋白质变性，破坏病毒完整性，导致病毒无法与细胞受体相结合或病毒无法正常脱壳，从而影响核酸的正常逸出，使病毒失去感染性。FCV中和试验过程中，应考虑FCV对温度敏感性的特点以及抗原与抗体在37℃中和1 h的影响，在进行FCV中和试验计算中和用毒病毒含量时，适当降低稀释倍数。

本研究对京津地区分离到的5株FCV进行VP1基因序列分析，发现5株FCV与疫苗株255株和F9株之间核苷酸同源性(73.4%～77.4%)和氨基酸同源性(82.5%～86.4%)较低。王浩等[16]分离到的1株广西分离株与疫苗株255株和F9株氨基酸变异率分别为46.7%和26.7%，这可能是疫苗免疫后不能对部分猫提供完全保护的重要原因。5株FCV与虎源性FCV毒株TIG-1株的核苷酸同源性(75.6%～76.8%)及氨基酸同源性(83.9%～86.7%)与其他毒株数据差异不大。杨清等[17]成功分离到1株虎源性FCV，提示FCV可能在猫和老虎甚至是其他猫科动物进行不同种属间的传播。相关研究发现基于ORF2核苷酸序列可将FCV毒株分为GⅠ和GⅡ两大进化群，GⅡ株群主要以国内分离的FCV毒株为主[18]。F2019BJ1株、F2019BJ2株和F2019TJ1株均属于GI株群，该株群主要以国外高致病性毒株为主，其原因可能是北京作为中国首都与国际间交流较多，而天津是因为与北京相邻的地理位置。F2019TJ2株和F2019TJ3株属于国内经典的GⅡ株群，这为后续筛选国内疫苗株提供了基础数据。虽然部分分离株属于同一株群，但其之间核苷酸同源性较低，更加证明了FCV的频繁变异。

FCV从发现能引起猫呼吸道症状至今已有50多年的历史了，由于其病毒聚合酶缺乏校对、保真度较低和不同FCV毒株之间的基因组重组而表现出高度的遗传多样性[19]。目前，在猫群中控制FCV的主要手段是接种疫苗。疫苗接种对于家养宠物猫能达到较好的防疫效果，但对于数量较多的流浪猫基地或其他猫养殖场所，病毒传播的概率更大，在疫苗接种的同时应加强饲养管理，定期对猫舍进行消毒，用餐时注意营养搭配且避免猫饲养密度过大。通过贝叶斯网络建模分析表明，减少群体规模和接种疫苗是与FCV感染直接相关的两个因素，也是控制FCV感染的主要目标[20]。商品化FCV疫苗分为弱毒苗和灭活苗，目前国内多使用多联灭活疫苗，免疫后能减轻一定的临床症状，但不能完全预防该病的发生，且接种过疫苗的猫对VS-FCV仍易感。FCV疫苗首免在6周龄～8周龄，3周～4周接种1次，共接种3次，之后每年注射1次进行免疫加强。感染FCV的猫大多食欲差，其原因主要是发热、口腔溃疡和因鼻腔充血引起的嗅觉失灵，可通过混合食物以增加香味，而非甾体抗炎药可用于治疗发热和口腔疼痛。对于较严重的与FCV相关的呼吸系统疾病，一般配合广谱抗生素进行治疗，以减少继发性细菌感染及相关的潜在并发症。目前，还没有直接作用的抗病毒药物被批准用于治疗FCV感染，VS-FCV的治疗也仅限于支持治疗[21-22]，所以FCV的疫苗接种和定期消毒十分重要。