新疆某马场马乳头瘤病毒1型全基因组测定及分析

宋小珍，佟盼盼，任美灵，张 磊，买占海，况 玲，谢金鑫

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

乳头瘤病毒(Papillomavirus，PV)是一种小的、无囊膜的、基因组约8 kb的环状、双链DNA病毒[1]。病毒根据其L1基因开放阅读框的核苷酸序列同源性分为不同种类的PVs[2-3]。PV可感染人、马和牛等多种动物。马乳头瘤病毒(Equuscaballuspapillomavirus，EcPV)1、2、3、4、5、6、7、8和9型，牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus，BPV)1、2和13型，和人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18，HPV-18)已被证明能够感染马[2,4-10]。

马乳头瘤病毒包括皮肤乳头状瘤(EcPV-1)、生殖器乳头瘤/乳头瘤病(EcPV-2和EcPV-7)、耳乳头瘤(EcPV-3、4、5和6)、全身性乳头瘤病(EcPV-8)和马肉瘤样病变(BPV-1和BPV-2)[2,4,5,7-9]。EcPV-1首次分离于1986年，广泛报道于国外3岁以下马匹中，引起马皮肤乳头瘤病，该病发病期为1个月～9个月，然后自然消退[2,3]。因皮肤乳头状瘤的患病马禁止交易、丧失观赏价值，给马产业带来严重的经济损失[3]。马感染乳头瘤病毒及其引起的乳头状瘤病在我国尚未见报道。事实上，仅报道过临床健康马粪便样品携带HPV-18[10]。2018年6月，本课题组在新疆昌吉市某马术俱乐部8岁纯血种公马鼻腔内观察到乳头状瘤样组织，因乳头状瘤样组织阻塞鼻腔，临床表现呼吸困难。基于高通量测序，在乳头状瘤样组织中检测到EcPV-1。为进一步了解我国EcPV-1分子特征，对其进行全基因组测定和分析，为新疆地区该病毒流行病学研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 采集新疆昌吉某马场编号为G2的8岁纯血种公马鼻内乳头瘤样组织和140匹健康纯血马鼻拭子样品，置-80℃保存。

1.1.2 主要试剂 组织DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒，旭基公司产品；DNA Marker DL 2 000，Takara公司产品；2×TransStart®FastPfu Fly PCR SuperMix、pEASY®-Blunt T、Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞和卡那霉素，全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪、台式高速离心机、台式低温高速离心机，德国Eppendorf公司产品；电泳仪和电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品；恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank登录的EcPV-1参考株设计用于全基因序列扩增的12对特异性引物，引物使用浓度10 μmol/L，引物由青岛派森诺生物技术股份有限公司合成(表1)。

表1 EcPV-1全基因组PCR引物

1.2.2 EcPV-1全基因序列测定 按照试剂盒方法提取马鼻腔内乳头瘤样组织样品DNA，以肿瘤样品提取的DNA为模板，采用表1中特异性引物，PCR扩增G2株全基因组，反应条件：98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收，并克隆于pEASY®-Blunt T中，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行Sanger测序。

1.2.3 EcPV-1同源性及遗传进化分析 根据GenBank中登录的相关序列，采用DNA Star软件对EcPV-1基因核苷酸和氨基酸进行同源性分析。利用MEGA7.0.26软件采用最大似然法(Maximum Likelihood methods)构建EcPV-1全基因组序列系统进化树，步展值重复1 000次进行评估。

2 结果

2.1 乳头瘤样组织样品的病毒宏基因组学分析

对采集的乳头瘤样组织样品经常规处理、PCR扩增后经病毒宏基因组学分析显示，共获得6 077 096条reads，长度为150核苷酸(nucleotide,nt)。其中有6 054条reads(占全部序列的0.01%)注释到哺乳动物病毒，分属于6个已知的病毒科和未分类的病毒，包括EcPV-1(2609 reads)、反转录病毒(109 reads)、圆环病毒样病毒(217 reads)、小双节RNA病毒(503 reads)、白血病病毒(313 reads)、诺如病毒(53 reads)和未分类病毒(2250 reads)。EcPV-1 2 609条reads注释到病毒的E6和L1基因，与EcPV-1参考株E6和L1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.8%。根据马匹编号(G2)，将高通量测序检测到的EcPV-1命名为G2株。

2.2 EcPV-1 G2株全基因组序列测定

根据马匹编号(G2)，将本研究检测到的EcPV-1命名为G2株。利用表1的12对特异性引物对G2株全基因组进行分段扩增，均获得相应的目的条带，胶回收、克隆测序后，目的条带长度分别为734、735、765、630、634、629、834、625、743、522、543、741 bp(图1)。Lasergene SeqMan对测得序列进行拼接，得到G2株全基因组序列。该毒株全基因组序列为7 611 bp(GenBank登录号为MN164462)，与EcPV-1美国株(AF498323)和日本株(MF288893)全基因组序列同源性为99.3%～99.4%。此外，未在同场30匹(<3岁)和110匹(>3岁)健康纯血马鼻拭子样品中检测到EcPV-1。

M.DNA标准DL 2 000；1～12.PCR产物M.DNA Marker DL 2 000；1-12.Amplification products

2.3 EcPV-1 G2株全基因组分析

EcPV-1 G2株与EcPV-1参考株E6、E7、E1、E2、E4、L2和L1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.0%～99.8%和97.7%～99.2%，而与EcPV-2-9参考株相应基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为30%～60%和12.1%～56.7%(表2)。

表2 EcPV-1 G2全基因组分析

2.4 EcPV-1 G2株全基因组序列遗传进化分析

以上述11株EcPVs为参考株，利用MEGA7.0.26软件构建EcPV-1全基因组序列进化树，结果显示G2株与EcPV-1参考株亲缘关系较近，处于进化分支中的Zata乳头瘤病毒属(图2)，与EcPV-2-9形成的Dyoiota、Dyorho和Treikaappa乳头瘤病毒属进化分支亲缘关系较远。

▲本研究发现病毒▲Virus identified in this study

3 讨论

已有报道显示EcPV-1感染3岁以下马匹，引起良性的自限性的皮肤乳头状瘤[1-3]，在发病1个月～9个月后自愈[2-3]。本研究首次在8岁成年纯血种公马鼻腔内观察到乳头状瘤样组织，并在该组织中检测到EcPV-1，表明该病毒存在于我国马群中，可感染年龄大于3岁的马匹，引起其乳头瘤病。本研究发现EcPV-1感染8岁马导致鼻内乳头瘤，可能与该马接触到EcPV-1时间较晚有关，也可能与对马鼻内乳头瘤的关注不够有关。纯血种公马在患病15个月后未自愈，因乳头状瘤样组织阻塞鼻腔，呼吸困难，种公马不能完成配种工作。另外，尽管未在该马场其他140匹纯血马鼻拭子样品中检测到EcPV-1，但患病马携带该病毒具有潜在感染其他马匹的风险，对同场马匹健康产生威胁。患病马已于2019年11月被淘汰处理。

Cook R H等[11]研究显示EcPV-1感染马匹66 d后产生皮肤乳头状瘤，本研究中患病纯血种公马于2012年购自西欧，发病前有去昌吉市其他马场的旅行史，同场其他马匹鼻拭子样品呈EcPV-1阴性，表明该纯血种公马在昌吉市其他马场感染EcPV-1。

与EcPV-1参考株L1基因编码框核苷酸序列相比，EcPV-1 G2 L1基因在192T、201A、206T、213T、215C、251C、252C、313A、330A、390T、443T、567T、597C、832C和973T位点碱基发生突变，EcPV-1 G2与EcPV-1参考株L1基因编码框核苷酸序列同源性为98.8%～99.1%。为了对新的PV进行分类，将新鉴定的PV与已知PV L1基因编码框核苷酸序列进行同源性分析，根据同源性命名为PV的新属(同源性<60%)、种(同源性≥60%，<70%)、型(同源性≥70%，<90%)、亚型(同源性≥90%，<98%)和变异株(同源性≥98%，<100%)[2-4]，表明G2株为EcPV-1新变异株。

本研究首次在国内鉴定EcPV-1，并对其全基因组序列进行遗传进化分析，为新疆地区该病毒的流行病学研究提供了参考依据。