UPLC-MS/MS法测定黄酒中8 种生物胺

王可利，叶 泰，徐 斐，曹 慧，袁 敏，于劲松，阴凤琴，吴秀秀

（上海食品快速检测工程技术研究中心，上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

生物胺是具有生物活性的低分子含氮有机化合物的总称，主要由氨基酸脱羧基后产生，也可通过微生物对醛酮的氨基转移作用产生[1]。生物胺广泛存在于各种食品中，如水产品、酒类产品、肉制品、乳制品等[2]，一般发酵食品中的生物胺含量明显高于非发酵食品[3]。作为氮源，适量的生物胺在人体的神经系统与心血管系统中能够参与DNA、RNA及蛋白质的合成、稳定生物膜以及调节胃酸分泌等重要生理作用[4]。但过量的生物胺会影响人体健康，引起一系列不良症状，如头痛、呕吐、腹泻、血压变化等，严重可致呼吸困难、休克甚至死亡，有些生物胺可与食品中的亚硝酸盐反应生成致癌的亚硝胺[5-6]。此外，生物胺也常作为评价贮存过程中，食品的新鲜度或腐败变质程度的重要指标[3]。

现有检测食品中生物胺的方法主要有液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10-11]、薄层色谱法[12-13]、毛细管电泳法[14-15]等仪器方法，其中最常用的是反相高效液相色谱法，样品经衍生化处理后连接紫外、荧光或二极管阵列检测器进行分析。Henríquez-Aedo等[16]采用高效液相色谱-荧光法在45 min内实现了智利葡萄酒中6 种生物胺的定量分析；曹利瑞等[17]建立了高效液相色谱-紫外法用于黄酒中9 种生物胺的检测，结果表明9 种生物胺可在40 min内分离。但是，这2 种方法均存在分析时间较长的缺点。为了更加快速地检测食品中生物胺，Sagratini等[18]建立了高效液相色谱串联质谱法，可在25 min内检测鱼中的8 种生物胺，其检出限范围为0.02～0.25 mg/kg；Yoon等[19]建立的高效液相色谱-紫外法，可在20 min内实现发酵农产品中8 种生物胺的快速定量分析，这种方法的检出限范围为0.01～0.1 mg/kg。虽然这2 种方法的分析时间较短，但仍然无法满足食品中痕量生物胺的快速分析、检测的需求。

黄酒是我国传统的发酵型酒精类饮料，含有丰富的氨基酸与维生素等营养物质，黄酒在发酵过程中，一些微生物（乳酸菌、酵母菌等）产生氨基酸脱羧酶，使游离的氨基酸脱羧形成相应的生物胺[20]。人体摄入黄酒后，生物胺经胃肠道黏膜上的单胺氧化酶、二胺氧化酶及多胺氧化酶等分解[21-22]，然而乙醇会抑制这些酶的活性[23-24]。李彬彬[25]和张来颖[26]等发现，体积分数低于10%的乙醇溶液可增加脱羧酶的活性[25-26]，而12%乙醇溶液会抑制91%的胺氧化酶活性[27-28]。我国黄酒中酒精含量一般在8.5%～17.0%之间。因此，黄酒中的生物胺会给人体带来更大的健康风险。本实验通过丹磺酰氯衍生化反应，优化萃取试剂的种类及检测条件，建立基于超高效液相色谱-串联质谱法检测8 种生物胺的方法，并考察其在黄酒样品中生物胺检测的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒样品 市购。

β-苯乙胺盐酸盐（纯度≥99%）、色胺盐酸盐（纯度≥98%） 上海麦克林生化科技有限公司；腐胺二盐酸盐、尸胺二盐酸盐、酪胺盐酸盐（纯度均不小于98%）、亚精胺三盐酸盐、精胺四盐酸盐（纯度均不小于99.5%）、组胺二盐酸盐、丹磺酰氯（纯度均不小于99%）、1,7-二氨基庚烷（纯度98%） 西格玛奥德里奇（上海）贸易公司；甲酸（质谱纯） 美国赛默飞世尔科技有限公司；乙腈（色谱纯） 德国默克公司；乙酸乙酯（色谱纯）、氨水、碳酸氢钠、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1290-6490超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国安捷伦科技公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司；0.22 μm一次性针头滤器 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 µm） 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相A：体积分数0.1%甲酸溶液，B：体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量2 μL；梯度洗脱：0～2 min，50% A、50% B；2～10 min，50%～25% A、50%～75% B；10～13 min，25%～0% A、75%～100% B；13～16 min，0% A、100% B；16～16.1 min，0%～50% A、100%～50% B；16.1～19 min，50% A、50% B。

1.3.2 质谱条件优化

取1.0 mL 250 ng/mL的生物胺混合标准溶液于15 mL离心管，依次加入250 μL内标溶液、1.0 mL饱和碳酸氢钠溶液、100 μL氢氧化钠溶液、1.0 mL衍生试剂按照1.3.4节样品前处理步骤衍生化处理后，注射泵直接进样，将标准物质注入质谱。8 种生物胺中均含有氨基，为极性碱性化合物，在结构上氮原子具有孤对电子，容易加合质子形成带正电荷的离子，在正离子模式扫描模式下响应值较高[29]，因此选择在电喷雾正离子模式下进行一级质谱扫描，确定母离子质量数，优化毛细管电压、喷雾电压、鞘气等参数，使母离子响应值达到最高，然后对母离子进行二级质谱扫描，优化碰撞能量等参数，使子离子响应值达到最高，得到多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）下的最佳离子对。

1.3.3 标准溶液与内标溶液的配制

准确称取8 种生物胺标准品适量，用0.1 mol/L盐酸溶液配制成质量浓度为1 000 mg/L的生物胺标准储备溶液，-20 ℃保存，保存期为6 个月。分别吸取1 mL的单组分生物胺标准溶液，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 mL，配制成质量浓度100 mg/L的生物胺混合标准溶液，-20 ℃保存，保存期为3 个月。准确吸取上述生物胺标准溶液，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释成终质量浓度为1、20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的生物胺混合标准工作溶液，现用现配。

准确称取内标物质（1,7-二氨基庚烷）适量，用0.1 mol/L的盐酸溶液配制成质量浓度10 mg/mL的内标标准储备溶液，-20 ℃保存，保存期为6 个月。准确吸取上述内标标准储备液，用0.1 mol/L的盐酸溶液稀释，配制成质量浓度250 ng/mL的内标使用液，现用现配。

1.3.4 样品前处理

准确量取1.0 mL黄酒样品、250 μL质量浓度250 ng/mL内标溶液、1.0 mL饱和碳酸氢钠溶液、100 μL 1 mol/L氢氧化钠溶液、1.0 mL衍生试剂（丹磺酰氯溶液质量浓度10 mg/mL）于10 mL塑料连盖离心管中，旋涡混匀1 min，60 ℃恒温水浴15 min后取出加入100 μL氨水，旋涡混匀，60 ℃水浴反应15 min，取出，冷却10 min，加入1.0 mL超纯水，旋涡混匀，氮气吹去丙酮，加入0.5 g氯化钠，振荡至完全溶解，加入5 mL乙酸乙酯，充分混匀后静置分层，吸取上层有机相，下层水相重复萃取1 次，合并2 次制得的有机相，氮吹至干。加入1.0 mL乙腈复溶，用0.22 μm滤膜针头滤器过滤，收集滤液，待测[30]。

1.4 数据处理

图谱的采集采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00软件，实验数据采用Excel 2019软件进行统计分析，Origin 2019 b软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

离子源扫描模式：电喷雾正离子模式；监测模式：MRM；氮气为载气；干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：12 L/min；鞘气温度：300 ℃；鞘气流量：11 L/min；雾化气压力：241 kPa；毛细管电压：4 000 V；喷嘴电压：500 V；质谱参数的驻留时间均为75 s、锥孔电压均为25 V、加速电压均为3 V；组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、亚精胺、精胺共8 种生物胺的定性、定量离子对中的母离子分别为m/z579、605、556、570、394、355、423、568，子离子均为m/z170。

2.2 色谱条件优化

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱采用桥式亚乙基杂化颗粒技术，对生物胺有良好的保留作用，并具有极高的分离效率，可以获得更快的分析速度与更高的灵敏性。分别选择纯水和甲醇、纯水和乙腈、0.1%甲酸和0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作为流动相，实验发现乙腈较甲醇的分离效果更好，流动相内加入0.1%甲酸后出现的峰形更好，无严重拖尾现象，因此，选用0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作为流动相。8 种生物胺的总离子流图如图1所示。

图1 8 种生物胺的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of eight biogenic amines

2.3 萃取试剂的选择

本实验比较分别用乙醚和乙酸乙酯萃取同一个样品的结果，结果如图2所示。2 种萃取剂均可将生物胺萃取出来，萃取效果无显著差异，但考虑到乙醚的毒性较大，因此，本实验选择乙酸乙酯作为生物胺萃取溶剂。

图2 不同萃取剂对生物胺组别萃取效果的影响Fig. 2 Effect of different extraction agents on the extraction efficiency of biogenic amines

2.4 线性范围、检出限与定量限

分别配制终质量浓度为1、2、50、100、250、500、1 000 ng/mL的生物胺混合标准溶液，经衍生化处理后，进行测定，以各生物胺质量浓度为横坐标，以对应生物胺与内标物质峰面积比作为纵坐标，绘制各生物胺的标准曲线，确定线性方程与线性相关系数。以信噪比为3作为检出限，信噪比为10作为定量限，测定结果见表1。结果表明，8 种生物胺的线性方程的线性相关系数r2均大于0.995 1，在各自线性范围内线性良好，检出限在0.25～0.50 ng/mL之间，定量限在1～2 ng/mL之间。均优于GB 5009—2016《食品中生物胺的测定》[30]中的检出限（2～5 mg/L）和定量限（5～10 mg/L）。

表1 8 种生物胺的线性方程、检出限与定量限Table 1 Linear equations, limits of detection and quantitation for eight biogenic amines

2.5 精密度

精密度分为日内精密度和日间精密度，以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。分别选取低、中、高3 个质量浓度（50、300、500 ng/mL）的生物胺混合标准溶液，按样品前处理步骤衍生化处理后，进行分析，3 个质量浓度的样品在24 h内每隔2 h重复进样6 次，计算各生物胺质量浓度RSD，记为日内精密度。连续3 d做重复性实验，计算3 d内各生物胺质量浓度RSD，记为日间精密度，测定结果见表2。8 种生物胺的日内精密度在0.61%～5.68%之间，日间精密度在0.82%～5.00%之间，具有良好的精密度和准确性。

表2 测定8 种生物胺方法的日内和日间精密度Table 2 Intra-day and inter-day precision of the method for the determination of eight biogenic amines

2.6 样品加标回收率

取同种黄酒样品3 份，稀释50 倍分别向其中加入质量浓度分别为30、100、200 ng/mL的生物胺混合标准溶液，按照样品前处理步骤衍生处理后，每个水平平行测定6 次，计算平均加标回收率及RSD，结果见表3。8 种生物胺的平均加标回收率在83.56%～117.45%之间，RSD均小于6.69%。

表3 黄酒中生物胺的平均加标回收率和RSD（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of eight biogenic amines from spiked Huangjiu (n = 6)

2.7 实际样品的测定

按照上述方法对10 个市售黄酒样品进行检测，10 个样品中均未检出色胺与精胺。10 个样品均检出组胺、腐胺和亚精胺，质量浓度分别为1.42～8.05、0.80～15.69 μg/mL和0.06～0.53 μg/mL，具体见表4。

表4 黄酒样品中生物胺的含量Table 4 Biogenic amine contents in Huangjiu samples determined by the method

3 结 论

本实验建立超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的方法同时检测黄酒中8 种生物胺。该方法采用丹磺酰氯进行柱前衍生，液-液萃取后结合内标法进行质谱检测，可在19 min内实现黄酒中8 种生物胺的定量分析，其具有分析速度快、灵敏度高与重复性好的优点，可用于我国黄酒产品的质量控制和安全评价。