曲霉型豆豉快速发酵工艺生产过程中的挥发性成分对比分析

文鹤，查双龙，胡祥飞，张盼文，杨慧林，王筱兰*

1(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022)2(食品科学与技术国家重点实验室(南昌大学)，江西 南昌，330027)

豆豉是我国传统发酵调味食品，因其风味独特、营养丰富而广受人们喜爱[1]，与印度尼西亚天培(tempe)、日本纳豆(natto)齐名[2]。豆豉一般以精选大豆为原料，通过微生物群落共同发酵而成。根据生产过程中优势微生物种类不同，可分成曲霉型、毛霉型、根霉型、细菌型和脉孢菌型豆豉五大类，其中曲霉型豆豉是我国南方地区销售量最大、食用范围最广的一类豆豉[3]。

我国豆豉生产多沿袭传统工艺，在半开放式环境中自然发酵，后发酵时间普遍长达半个多月，如以浏阳豆豉[4]、阳江豆豉[5]、南昌豆豉[6]为代表的曲霉型豆豉；部分甚至达到10～12个月，如以潼川豆豉[7]、永川豆豉[8]等为代表的毛霉型豆豉。传统工艺中粗放的自然发酵过程极易受外界环境、温度及微生物的影响，进而导致豆豉的风味、品质不稳定，难以适应消费者对食品安全及卫生等要求[9]。曲霉型豆豉传统工艺中一般还采用拌盐发酵，长时间摄入高盐会增加患高血压等慢性病的风险，不符合健康饮食的主流理念[10]。

豆豉传统生产工艺存在一系列的缺点亟待改进，如何缩短生产周期、提高生产水平、改良产品品质成为豆豉生产企业急需解决的难题。新型快速发酵工艺应运而生，江西南昌稻香园调味食品有限公司曲霉型豆豉的生产工艺有快速工艺和传统工艺2种，二者前期生产流程相同，尽可能保留传统工艺中豆豉特有的风味。唯一区别是在后酵阶段,快速工艺曲霉型豆豉生产时，后酵阶段不拌盐，在发酵罐中进行控温发酵，发酵起始温度高达50～60 ℃，后发酵仅需7 d；传统工艺在后酵阶段拌盐(6%～7%)，在发酵池中自然发酵，发酵起始温度仅35～50 ℃，后发酵时间长达21 d。快速工艺生产曲霉型豆豉不仅能克服传统工艺后发酵过程中开放不可控的弊端，还能降低豆豉成品中含盐量，大大缩短生产周期，为企业带来可观的经济效益。

由于生产工艺、生产地区及优势微生物的区别，不同类型豆豉的风味物质种类和含量会存在较大差异。豆豉风味由多种挥发性成分组成，一般先采用同时蒸馏-萃取法、顶空法、超临界流体萃取法、干馏法或固相微萃取法提取，再通过气相色谱-质谱联用法分析鉴定挥发性成分[11]。传统工艺下生产的豆豉挥发性成分变化，前人已做过大量研究，如蒋立文等[12]通过顶空固相微萃取和气质联用方法鉴定出毛霉型豆豉中有68种挥发性成分；李金林等[6]通过固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(solid phase micro-extraction-GC-MS,SPME-GC-MS)鉴定出曲霉型豆豉中有50种挥发性成分；韩帅等[13]通过同时蒸馏萃取加气-质联用技术鉴定出浏阳豆豉中111中挥发性成分。而快速工艺作为一种豆豉新型现代化生产工艺，相关资料较少，该工艺下豆豉挥发性成分变化未见报道。

本研究拟采用SPME-GC-MS对快速工艺生产曲霉型豆豉蒸煮、制曲、洗曲及后酵4阶段的挥发性成分进行萃取及鉴定，探讨快速工艺曲霉型豆豉生产中主要风味物质和香味成分变化，对比之前我们课题组采用传统工艺制作的曲霉型豆豉挥发性成分，为快速工艺生产曲霉型豆豉的标准化、工业化生产提供理论参考及进一步研究风味物质形成的机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

曲霉型豆豉，江西南昌稻香园调味食品有限公司；正烷烃C8～C40混合标品，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取装置和DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；7890A/5975气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制作、采集与处理

曲霉型豆豉快速生产工艺流程：

原料(黑豆)→筛选→洗涤→浸泡→沥干→蒸煮→冷却→制曲(温度25～30 ℃，7 d)→洗曲→后酵(温度：50～60 ℃，7 d)→烘干→包装→产品

样品采集:在江西南昌稻香园调味品有限公司快速工艺曲霉型豆豉生产车间进行采样，同一生产周期内分批采集样品，每次取样时，在同一发酵罐的上、中、下3层(深度分别为5、15、25 cm)取样，取样后充分混匀，取经蒸煮冷却后的黑豆，自然制曲7 d的黑豆曲胚，洗曲堆积的坯料和后发酵7 d的豆豉样品，每组样品采集4份，采集后用无菌的塑封袋密封，冰袋冷藏带回实验室，置于实验室-20 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 SPME萃取挥发性成分

将DVB/CAR/PDMS萃取头按照说明书事先进行老化备用，分别将蒸煮冷却后黑豆、自然制曲7 d的黑豆曲坯、洗曲堆积的坯料和后发酵7 d的豆豉样品进行研磨，过40目筛，制得样品。参照李金林等[6]方法准称取3.00 g样品，加入到15 mL顶空进样瓶中，采用恒温水浴加热，60 ℃平衡20 min，将SPME装置置于顶空进样瓶上方，60 ℃恒温萃取30 min后取出，开展GC-MS分析(每个样品设置3组重复)。

1.3.3 GC-MS 分析条件

色谱条件：Agilent 19091S-433 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃，载气He，流速1.0 mL/min，分流进样；升温程序：起始40 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至85 ℃，10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min[14]。

质谱条件：离子源EI，电离电压70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；全扫描模式，质量扫描范围35～400 amu。

1.3.4 成分鉴定及含量计算

各组分质谱信息采用NIST08质谱库检索，根据保留时间(retention time，RT)确定豆豉样品中挥发性成分，样品采用C8～C40系列正烷烃混合标品分析，根据文献[15]计算线性保留指数(linear retention indice，LRI)，同时将各组分实测LRI与NIST数据库比对，以进一步确定各组分的成分，挥发性成分的相对含量分析用峰面积归一化法计算[14, 16]。

2 结果与分析

2.1 曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分的总离子流色谱图

快速工艺下曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分用SPME萃取后再通过GC-MS分析，得到样品中挥发性成分GC-MS总离子流色谱图,由图1可知，色谱峰较均匀分布在0～40 min，并且丰度较高，说明GC-MS条件适宜[17]。SPME是根据萃取头极性不同，通过相似相溶原理萃取不同的物质，李金林等[6]发现豆豉中挥发性物质极性成分占比较高，而DVB/CAR/PDMS萃取头属于中等极性，适用于萃取中等极性和极性化合物，这说明用DVB/CAR/PDMS萃取头对豆豉样品进行SPME萃取较为合适。

2.2 曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分种类、数量及相对含量分析

采用NIST08质谱库检索和NIST数据库比对，进一步确定检测到的挥发性成分，结果如表1所示。快速工艺曲霉型豆豉在蒸煮阶段共检测出67种挥发性成分，其中酯类4种、酮类9种、酚类4种、醇类13种、醛类14种、酸类7种、吡嗪6种、呋喃3种、芳香族2种、其他5种；制曲阶段共检测出70种挥发性成分，其中酯类4种、酮类5种、酚类3种、醇类13种、醛类9种、酸类10种、吡嗪9种、呋喃3种、芳香族4种、其他10种；洗曲阶段共检测出67种挥发性成分，其中酯类5种、酮类5种、酚类3种、醇类13种、醛类7种、酸类9种、吡嗪8种、呋喃3种、芳香族8种、其他6种；后酵阶段共检测出81种挥发性成分，其中酯类14种、酮类9种、酚类5种、醇类7种、醛类10种、酸类10种、吡嗪10种、呋喃3种、芳香族6种、其他7种。通过与李金林等[6]研究的传统工艺曲霉型豆豉对比发现，2种工艺在后酵阶段挥发性成分种类及含量存在较大差别，传统工艺后酵阶段仅检出45种挥发性成分，挥发性成分种类远远低于快速工艺。无论是从挥发性成分种类还是从挥发性成分含量来看，快速工艺产生挥发性成分的种类更多、峰值更大，而曲霉型豆豉特有的酯香、醇香、豉香和酱香是由多种挥发性成分共同造就的，说明快速工艺比传统工艺在后酵阶段生成更为丰富的挥发性成分，快速工艺生产的豆豉不仅风味物质高于传统生产工艺的标准，而且比传统工艺生产的豆豉香气成分更突出，能赋予豆豉更浓郁的风味。

a-蒸煮阶段；b-制曲阶段；c-洗曲阶段；d-后酵阶段图1 曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion flow chromatography of volatile components in Aspergillus-type Douchi production

表1 曲霉型豆豉生产不同阶段样品主要挥发性成分Table 1 The main flavor compounds identified in samples from different process of Aspergillus-type Douchi production

续表1

由图2可知，从挥发性成分种类来看，快速工艺下曲霉型豆豉在蒸煮、制曲和洗曲3阶段挥发性成分种类分别为67、70、67种，种类上并没有太大变化，而到后酵阶段挥发性成分数量开始攀升至81种。从挥发性成分含量来看，快速工艺下曲霉型豆豉在制曲阶段仅形成少量挥发性成分，挥发性成分主要在后酵阶段形成，这与李金林等[6]传统工艺生产曲霉型豆豉的研究结果一致。蒸煮阶段挥发性成分种类前3的分别是醇、酚和醛；制曲阶段挥发性成分种类前4的分别是醇、芳香族、酸和呋喃；洗曲阶段挥发性成分种类前4的分别是酸、醇、芳香族和呋喃；后酵阶段挥发性成分种类前4的分别是醛、酸、酚和吡嗪类，后发酵阶段，在微生物的作用下产生了大量醛类化合物。

a-挥发性成分数量变化；b-挥发性成分含量变化图2 曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分种类、数量及含量变化Fig.2 Chang in species, amount, and content of volatile compounds in Aspergillus-type Douchi production

2.3 曲霉型豆豉生产过程中挥发性成分对比分析

在生产过程中，原料经过浸泡，吸收水分后(吸水率67%～95%)变得松软，蒸煮时原料中的蛋白质(含量约为40%)能迅速变性，淀粉(含量约为30%)易糊化。同时溶解出制曲阶段霉菌所需要的营养成分，并提供霉菌生长所必需的水分；蒸煮阶段主要目的是破坏大豆内部分子结构，主要进行蛋白质变性和淀粉糊化等反应，同时起到灭菌的作用；制曲阶段主要是在曲房中自然制曲，空气中霉菌孢子通过自然附着接种，该阶段优势微生物主要为曲霉和横梗霉[18]，通过霉菌产生复杂的酶类(如蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶等)水解蛋白质、淀粉、脂质等大分子物质，产生氨基酸、脂肪酸、甘油和糖类等风味前体物质。洗曲阶段主要是通过水洗去除制曲过程中豆豉表面附着的孢子、菌丝和部分酶，因为孢子呈苦涩味，部分蛋白酶水解会产生苦味肽，水洗可降低苦味和涩味等不良风味[19]。快速工艺在后酵阶段发酵起始温度高达50～60 ℃，后发酵仅7 d，而传统工艺在后酵阶段发酵起始温度只有35～50 ℃，后发酵时间长达21 d。有研究表明中高温发酵通常可提升各类生化反应的反应速率进而达到缩短发酵周期的目的[20]。

结合表1和图2可知，曲霉型豆豉在蒸煮阶段挥发性成分主要为醇、酚和醛，分别占该阶段总挥发性成分的70.57%、11.27%和9.43%，三者之和占总挥发性成分的91.72%。其中醇类化合物中1-辛烯-3-醇占蒸煮阶段总挥发性成分的43.11%，该化合物又名蘑菇醇，具有蘑菇和泥土似的清香，是蒸煮阶段豆腥味的主要来源[21]。在经过制曲阶段后，1-辛烯-3-醇仍占制曲阶段总挥发性成分的46.42%，而经过洗曲阶段后，其相对含量下降到14.69%，到后酵阶段1-辛烯-3-醇不再被检测到，说明其对豆豉风味的贡献度不大，范琳等[21]在研究曲霉型豆豉时也有此发现。正己醇占蒸煮阶段总挥发性成分的18.36%，具有酒香、果香和脂肪香等美好风味，其经过制曲、洗曲和后酵阶段后逐渐减少到最后不再被检出，推测可能是与其他物质反应生成酯类或醛类风味物质。甲基麦芽酚占蒸煮阶段总挥发性成分的11.27%，具有甜香、浆果香和脂肪香等美好风味，在后酵阶段其相对含量仍占6.51%，是豆豉特殊风味的来源之一。这3种挥发性成分之和占蒸煮阶段总挥发性成分的72.74%，是该阶段风味的主要来源。

在制曲阶段挥发性成分主要是醇、芳香族、酸和呋喃，分别占该阶段总挥发性成分的54.51%、7.09%、6.57%和5.43%。在蒸煮阶段产生的1-辛烯-3-醇仍占总挥发性成分的46.42%，表明该阶段仍以豆腥味为主。值得注意的是酸、芳香族、呋喃、吡嗪类化合物的相对含量开始攀升，酸类化合物峰面积由蒸煮阶段的(32.1±1.95)×105mAu·min增长至(151.24±3.34)×105mAu·min。这可能是制曲阶段优势微生物(曲霉、芽孢杆菌及葡萄球菌等)产生的脂肪酶水解大豆中丰富的脂肪(含量约为20%)生成脂肪酸和甘油，甘油再转化为有机酸造成的[20]。醇类物质可由羰基化合物通过还原作用或微生物代谢生成，大量酸类物质的存在可以和醇类化合物通过酯化反应形成酯类化合物[21]，这可能是蒸煮阶段产生的正己醇在制曲阶段快速下降的原因。2-正戊基呋喃的含量快速累积，该化合物是一种带有清香、果香、焦糖味的食品用香料，呋喃和吡嗪是典型的美拉德反应产物，美拉德反应是由羰基化合物(如还原糖、脂质等)和氨基化合物(如蛋白质、氨基酸等)反应产生的非酶褐变现象[20]。但呋喃和吡嗪的峰面积均较小，说明快速工艺下曲霉型豆豉在制曲阶段仅进行轻度的美拉德反应，这与传统工艺一致。

在洗曲阶段挥发性成分主要为酸、醇、芳香族、呋喃，分别占总挥发性成分的33.24%、20.36%、11.90%和6.10%。该阶段挥发性成分除1-辛烯-3-醇外基本没有大的变动，1-辛烯-3-醇峰面积由制曲阶段的(1 069.38±6.59)×105mAu·min锐减至(462.87±11.81)×105mAu·min，其他挥发性成分相对含量发生变化可能是由于大量1-辛烯-3-醇被水洗掉所导致的。

在后酵阶段挥发性成分主要为醛、酸、酚、吡嗪，分别占该阶段总挥发性成分的34.33%、29.85%、11.07%和7.28%。快速工艺后酵阶段的总峰面积高达(8 525.21±31.8)×105mAu·min，而传统工艺后酵阶段挥发性成分主要是醛、酯、醇和酚，后酵阶段的总峰面积仅为(1 130.64±1.78)×104mAu·min，酯类是传统工艺下后酵阶段形成最多的一类物质，而醛类是快速工艺下该阶段形成最多的一类物质。这说明快速工艺生产的曲霉型豆豉多层次风味得到加强，风味物质主要组成也发生很大的变化，快速工艺在生产豆豉上存在较大优势，赋予豆豉花香、甜香、脂香、坚果香等美好风味。快速工艺在后酵阶段共检测出20种新的挥发性成分，绝大多数在制曲阶段形成的挥发性成分都得到加强，其中比较突出的代表有苯甲醛、可卡醛、愈创木酚、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、苯乙醛、异戊酸、甲基麦芽酚、4-甲基戊酸、2-乙酰基吡咯等。但作为豆腥味主要来源的1-辛烯-3-醇不再被检测到，说明其对豆豉风味的贡献度不大，范琳等[21]在研究曲霉型豆豉也有此发现。苯甲醛在蒸煮、制曲和洗曲阶段含量并不突出，却是后酵阶段含量增长最多的化合物，相对含量占该阶段总挥发性成分的17.82%。它是一种工业上常用的芳香醛，具有强烈的杏仁气味，同时具有甜香、坚果香和樱桃味等良好风味，是豆豉中重要的呈香物质[22]。而可卡醛是仅在后酵阶段才检测到的挥发性成分，主要在后酵阶段由微生物代谢生成，相对含量占该阶段总挥发性成分的11.63%，具有甜香、可可香、坚果香等良好风味[23]。异戊酸是酸类化合物中的主要成分，占总挥发性成分的18.77%，常用于香料生产，具有酸味，奶油味，甜味，浆果味等风味[24]。愈创木酚是酚类化合物中形成最多的物质，赋予豆豉木香、果香、熏肉香、焦糖香、浆果香等风味。2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪是吡嗪类化合物迅速增长的代表，而吡嗪是典型的美拉德反应产物，美拉德反应贡献主要表现在豆豉颜色变化、滋味提升及风味物质的形成等方面，直接影响豆豉酚、醛、呋喃、吡嗪等风味物质或前体物质的形成，类黑精的产生能赋予豆豉黑色的外形。随着发酵进行，快速工艺的发酵罐生物热累积，温度由制曲阶段的25～30 ℃上升到后酵阶段的50～60 ℃[25]，而温度是影响美拉德反应的主要原因，一般每相差10 ℃，反应速度相差3～5倍。且吡嗪和呋喃类挥发性成分含量升高，说明快速工艺后酵阶段美拉德反应更为剧烈。

3 结论

本实验采用SPME-GC-MS对曲霉型豆豉快速工艺生产过程中的蒸煮、制曲、洗曲及后酵4阶段挥发性成分进行鉴定，结果发现，在蒸煮阶段共检出67种挥发性成分；制曲阶段共检出70种挥发性成分；洗曲阶段共检出67种挥发性成分；后酵阶段共检出81种挥发性成分。从挥发性成分种类和含量来看，曲霉型豆豉快速工艺在制曲阶段仅形成少量挥发性成分，挥发性成分主要在后酵阶段形成。在蒸煮阶段挥发性成分主要为醇、酚和醛，分别占该阶段总挥发性成分的70.57%、11.27%和9.43%，三者之和占总挥发性成分的91.72%，1-辛烯-3-醇、正己醇、甲基麦芽酚是蒸煮阶段主要的挥发性成分，其中1-辛烯-3-醇是豆腥味的主要来源。在制曲阶段挥发性成分主要是醇、芳香族、酸和呋喃，分别占该阶段总挥发性成分的54.51%、7.09%、6.57%和5.43%。在蒸煮阶段产生的1-辛烯-3-醇仍占总挥发性成分的46.42%，该阶段仍以豆腥味为主。值得注意的是该阶段已经发生轻度的美拉德反应，酸、芳香族、呋喃、吡嗪类化合物的相对含量开始攀升，主要的挥发性成分分别是1-辛烯-3-醇、苯乙烯、2-正戊基呋喃，大量酸类化合物和醇类化合物通过酯化反应形成酯类化合物。在洗曲阶段挥发性成分主要为酸、醇、芳香族和呋喃，分别占总挥发性成分的33.24%、20.36%、11.90%和6.10%。该阶段大量1-辛烯-3-醇被水洗掉，其他挥发性成分基本没有大的变动。

在后酵阶段挥发性成分主要为醛、酸、酚和吡嗪，分别占该阶段总挥发性成分的34.33%、29.85%、11.07%和7.28%，共检测出20种新的挥发性成分，醛是曲霉型豆豉快速工艺后发酵阶段形成最多的一类物质，绝大多数在制曲阶段形成的挥发性成分都得到加强，其中比较突出的代表有苯甲醛、可卡醛、愈创木酚、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、苯乙醛、异戊酸、甲基麦芽酚、4-甲基戊酸、2-乙酰基吡咯等。其中苯甲醛在蒸煮、制曲和洗曲3阶段含量并不突出，却是后酵阶段含量增长最多的化合物；可卡醛、4-甲基戊酸、2-乙酰基吡咯是仅在后酵阶段才检测到的挥发性成分；作为豆腥味主要来源的1-辛烯-3-醇不再被检测到，说明其对豆豉风味的贡献度不大。快速工艺后酵阶段美拉德反应剧烈，形成了大量的美拉德反应产物，如吡嗪、呋喃等。快速工艺在生产曲霉型豆豉上存在较大优势，快速工艺比传统工艺形成的挥发性成分种类更多、峰值更大，豆豉多层次的风味得到加强，赋予豆豉更浓郁的花香、甜香、脂香、坚果香、熏肉香等美好风味。无论是从挥发性成分的种类还是从含量来看，后酵阶段是豆豉挥发性风味物质形成的主要阶段。而曲霉型豆豉风味物质形成是多种微生物互相作用的结果，相关风味物质形成与功能微生物之间的关联还需要进一步探究。