基于气相色谱-嗅闻-质谱技术结合化学计量法分析小曲清香型白酒醛异味成分

孙细珍，左可成，唐娟,2，熊亚青,2，乐细选，杜佳炜,2，钱全全，陈雅慧，杨强

1(劲牌有限公司，湖北 黄石，435100)2(中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石，435100)

小曲清香型白酒是指以粮谷为原料，以小曲作糖化发酵剂酿制的白酒，是中国白酒的主要酒种之一[1]，广泛分布于四川、重庆、贵州、云南、湖北等地[2]。小曲清香型白酒具有历史文化悠久，用曲量少、发酵周期短、贮存时间短、出酒率高等特点[3]，且因其酒体醇甜柔和、清香纯正的独特风味长期以来受到消费者的喜爱。

在酒精饮料的酿造过程中，因发酵条件控制不当、工艺操作及管理不善、各种工作用具及生产场所不洁都可能会导致异嗅味物质的产生[4]。异嗅味物质会造成酒体的口味、香气的不协调，对产品质量有重要影响，当前国内外对酒精饮料中的异嗅味开展了较多研究。KINZURIK等[5]采用顶空固相微萃取(head space-solid phase microextraction，HS-SPME)结合气相色谱质谱解析出引起葡萄酒产生煮熟的洋葱和蔬菜味的化合物为乙硫醇、硫代乙酸乙酯和二乙基二硫；徐岩等[6]确认浓香型白酒产生窖泥臭的化合物是4-甲基苯酚，该物质感官描述为窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、动物臭；王露露[7]采用气相色谱-嗅闻-质谱(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS)技术结合香气活力值(odor activity value,OAV)，从“盐菜味”异嗅样品和正常样品中筛选出23种含量差异显著的重要香气化合物；进一步通过化学计量法结合香气添加、缺失实验，发现2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇等“量微香大”的含硫化合物含量失调是造成酱香型白酒“盐菜味”缺陷的关键因素。目前国内外对小曲清香型白酒异嗅味物质研究少见报道，醛异味是小曲清香型白酒极为常见的风格缺陷，感官描述为类似青草、过熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的复合气味，严重影响小曲清香型白酒的风味与品质。因此，明晰小曲清香型白酒中醛异味物质，对更好地控制与提升其风味品质具有重要意义。

本实验以醛异味和正常的小曲清香型白酒为研究对象，基于感官分析，采用GC-O-MS、HS-SPME/GC-MS技术对2种样品的挥发性成分进行比较，通过香气强度与OAV鉴定2组样品在重要风味物质上的差异性；进一步采用偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)方法对2组样品进行判别分析，明确醛异味样品和正常样品间的显著差异性香气成分，为生产工艺的改进提供数据支持与优化方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小曲清香型白酒试验样品，共19批；其中1批为标准样品(编号为SS-1)，供感官分析时参比用；另外18批供本试验研究用，全部由劲牌有限公司(中国湖北)提供。

本研究所用标准品均为色谱纯，购于上海安谱实验科技股份有限公司；所用化学试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；所用水均为超纯水，为本实验室自制。

1.2 仪器与设备

AB135-S十万分之一电子分析天平，美国Mettler-Toledo公司；FA2004万分之一天平，上海精密科学仪器有限公司；DC12H氮吹仪，上海安谱科技有限公司；7890B-5977C气质联用仪、8890气相色谱仪(配氢火焰离子化检测器，GC-FID)、DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、CP-WAX色谱柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)、HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent科技有限公司；嗅闻仪(ODP 4，Gerstel GmbH & Co.KG, Mülheim, Germany)、MPS 2多功能样品前处理平台，德国Gerstel公司；DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm)，美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 感官评价与样品分级

小曲清香型白酒的感官评价和样品分级由劲牌公司10名专业评酒委员组成感官评价小组(其中国家级评酒委员5人、省级评酒委员5人)，在感官描述分析中均具有长期经验。参考文献[8-9]和EN ISO 8589《感官分析 试验室设计的一般指南》、GB/T 10345—2007，就醛异味对小曲清香型白酒与标准样品SS-1(醛味强度为2)进行对比讨论。小组成员在3点强度等级上以随机顺序对样品的醛异味进行评级(1=低，2=中等，3=强)，强度>2的样品分为醛异味样品，强度≤2的样品分为正常样。

1.3.2 液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)分析

参考文献[10]方法稍做改进，采用LLE方法提取小曲清香型白酒O-1和N-1样品的香气物质。取100 mL样品用超纯水稀释至体积分数为10%，加入氯化钠至饱和，再加入二氯甲烷进行提取(提取3次，每次70 mL)，合并有机相，加入无水Na2SO4在4 ℃下过夜脱水，过滤后的提取液在40 ℃下氮吹浓缩至约2 mL，所得浓缩液用于GC-MS及GC-O分析。

1.3.3 GC-MS和GC-O分析

LLE提取液分别经HP-5MS和DB-FFAP色谱柱进行GC-O-MS分析。

气相色谱条件：DB-FFAP色谱柱的升温程序为初温50 ℃，以3.5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，再以15 ℃/min升至250 ℃；HP-5MS色谱柱的升温程序为初温50 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以30 ℃/min升至320 ℃，保持10 min；载气为高纯氦气，流速为1 mL/min，进样口温度为280 ℃，进样量为1 μL，不分流进样。

质谱条件：电子轰击源能量为70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；辅助通道加热温度280 ℃；全扫描模式及特征离子扫描模式，扫描质量35～350 u。

GC-O条件：在配有ODP4嗅闻仪的GC-MS上进行，样品经DB-FFAP色谱柱分离后按照1∶1的分流比流入嗅闻仪及GC-MS；嗅闻仪传输线温度为250 ℃，嗅闻口温度为200 ℃，加湿器流速50 mL/min。3名评价人员(1名男性和2名女性)进行GC-O分析，分析过程中将鼻子置于嗅闻口前，记录色谱流出物保留时间、香气特性和香气强度。每个评价人员重复分析2次，最终结果以3个评价人员平均值计。在进行GC-O分析前，评价人员要对标准品(浓度高于其在空气、水中的嗅觉阈值)进行反复嗅闻，并经过长达3个月的GC-O嗅闻训练。

1.3.4 定性分析

香气化合物采用NIST14谱库检索进行初步定性；将样品、标样和C5～C30正构烷烃标准品在同样GC-MS分析条件进行分析，根据待测物质的保留时间，计算保留指数(retention index, RI)对物质进行鉴定，RI计算如公式(1)所示：

(1)

式中：RI为保留指数；n为正构烷烃的碳原子数；Rt(n+1)、Rt(n)分别代表碳数为n+1、n的正构烷烃的保留时间，min；Rt(x)为被测组分保留时间，min，且Rt(n+1)>Rt(x)>Rt(n)。

1.3.5 定量分析

对GC-O分析中香气强度≥2的香气物质采用内标法进行定量分析。准确称取各标准物质,用无水乙醇配制成标准储备液，用体积分数60%的乙醇溶液逐级稀释成7个浓度梯度的标准工作溶液，向其中加入适量内标溶液，绘制标准曲线。其中异戊醇、乙酸乙酯、乙缩醛等物质采用GC-FID定量分析；辛酸乙酯、癸酸乙酯、戊酸乙酯等物质采用HS-SPME进行定量分析。定量标准品的线性范围最低浓度必须保证其色谱图信噪比≥10。所有样品重复测定3次。

1.3.5.1 GC-FID分析条件

白酒中的常量挥发性物质通过GC-FID直接进样分析，准确吸取1.0 mL样品于样品瓶中，加入10.0 μL内标溶液(IS1：叔戊醇，18 000 mg/L；IS2：乙酸正戊酯，15 000 mg/L；IS3-1：2-乙基己醇，12 000 mg/L)，混合均匀后直接进样供气相色谱分析。气相色谱条件：CP-WAX色谱柱，升温程序：初温35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升到70 ℃，以3.5 ℃/min升到190 ℃，保持22 min；载气为高纯氮气，恒流模式，流速为1 mL/min，进样口温度为250 ℃，检测器温度为260 ℃，进样量为1 μL，分流进样，分流比为30∶1。所有样品重复测定3次。

1.3.5.2 HS-SPME分析条件

参考文献[9]方法稍做改进，将待测样品用超纯水稀释至体积分数10%，取8 mL稀释液于20 mL顶空瓶中并加氯化钠至饱和，加入10.0 μL内标溶液(IS3-2：2-乙基己醇，100 mg/L；IS4：2-辛醇，100 mg/L),充分混合并在50 ℃下孵育5 min以达到平衡，将老化(250 ℃下老化30 min)后的固相微萃取纤维头插入顶空瓶中并萃取45 min，定期振动(每振动10 s后停止2 s)，萃取结束后将纤维头插入GC-MS进样口，在250 ℃下解吸5 min，在DB-FFAP色谱柱中采用1.3.3 中仪器条件进行HS-SPME/GC-MS分析。通过空白试验和加标试验考察基质效应，所有样品重复测定3次。

1.3.6 OAV计算

各物质的OAV等于其浓度与阈值的比值，此研究中化合物阈值Ti主要参考文献。一般认为，当OAV<1时，说明该物质对样品总体气味贡献不明显；当OAV≥1时，说明该物质对样品总体气味有明显贡献，OAV越大说明该物质对样品总体气味的贡献程度越大。

1.4 数据统计与分析

应用SPSS 22.0对不同样本之间的最小显著差异进行单因素分析，α≤0.05被认为具有统计学差异；使用Origin 8.6对数据进行说明；使用Umetrics公司SIMCA 13.0软件进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和OPLS-DA，进一步对正常样品和醛异味样品的定量结果进行差异性分析，筛选出显著性差异化合物。

2 结果与分析

2.1 感官分析结果

感官分析小组在专业品酒室(恒温20 ℃)嗅闻酒样，综合各评价成员的分析结果，并经讨论后从18个供试验样品中筛选出11个正常样品(用JPXQLN表示，设为组N，编号为N-1～N-11)、7个醛异味样品(用JPXQLO表示，设为组O，编号为O-1～O-7)。

2.2 定性分析

香气化合物的鉴定是通过RI、香气描述以及MS库的比对，最后通过标准品进行确认。在小曲清香型白酒中鉴定出香气强度≥2的香气物质共61种(表1)，包括9种脂肪酸、26种酯类、1种内酯、12种醇类、7种醛类、1种缩醛类、3种酮类和2种酚类。其中脂肪酸化合物主要呈现酸臭、汗臭和窖泥臭等；酯类化合物呈现花香和水果香；醇类物质主要呈青草香、花香，而烯醇的风味则呈青草、尘土风味；醛类化合物呈现坚果香和花果香。对比醛异味和正常小曲清香型白酒样品，发现上述61种香气物质均同时存在，其中55种香气物质在2种白酒样品中香气强度值基本相同，醛异味样品中丁酸、乙醛、正丙醇和乙缩醛香气强度值高于正常样品，戊酸乙酯、己酸乙酯香气强度值则低于正常样品。

表1 醛异味和正常小曲清香型白酒的挥发性成分鉴定结果Table 1 Results of volatile compounds in JPXQLO and JPXQLN

2.3 定量结果

为了进一步明确醛异味和正常样品中挥发性成分的差异性，本研究采用GC-FID结合HS-SPME/GC-MS方法对定性出的61种风味物质进行了定量分析，所定量的风味物质标准曲线线性良好，R2均在0.990以上，定量参数信息及定量结果见表2。

续表2

从表2可知醛异味样品中OAV≥1的化合物有32种，正常样品中OAV≥1的化合物有31种，在乙缩醛、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯上醛异味样品的OAV高于正常样品，而在丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯等酯类物质上醛异味样品的OAV低于正常样品，这与2.2中的GC-O分析结果接近，表明醛异味样品与正常样品间的差异主要来源于挥发性物质的含量与比例关系。

2.4 香气化合物的判别分析

小曲清香型白酒组成中98%是乙醇和水，另外2%的微量成分种类繁多复杂并存在交互作用，决定着小曲清香型白酒的风味与质量，因此很难通过简单的数据分析获得有效的变量，为有效区分醛异味样和正常小曲清香型白酒，明确引起醛异味的来源，本研究采用多元统计方法对两者进行分析。多元统计分析手段能够在多个对象和多个指标互相关联的情况下分析目标样品的统计规律，因此被广泛运用于食品科学领域。其中 PCA是常见的统计学分析手段，在酒类、茶叶、食品工艺等领域的判别分析上有广泛应用[22]。

OPLS-DA变量重要性因子(variable importance in the projection，VIP)可以量化每个变量对分类的贡献，VIP值越大，变量在不同类别间差异越显著，当VIP值>1时，可界定对应的变量为该判别模型的关键变量[24]。本研究所建立的OPLS-DA模型中，VIP值>1的化合物共有13种，它们分别是乙醛(VIP=1.96)，过量的乙醛产生青香、青草、烂熟的苹果香等异嗅，在醛异味的小曲清香型白酒中含量明显高于正常样；乙缩醛(VIP=1.79)，呈青水果、黄油气味；正丙醇(VIP=1.07)，具有醇香和成熟水果香、青草气味；乙酸(VIP=1.07)，呈酸的、醋、刺激性和不愉快的气味；糠醛(VIP=1.79)是最重要的呋喃类化合物之一，呈甜香、焙烤香；丙酸(VIP=1.16)，呈现明显的酸或醋气味以及干酪、腐等刺激性气味；3-羟基-2-丁酮(VIP=1.04)、丁酸(VIP=1.08)，有腐臭、干酪、汗臭、酸臭、窖泥臭；异戊酸(VIP=1.70)，呈现酸、干酪、汗臭、腐败气味；辛酸(VIP=1.45)，有似山羊臭、干酪、脂肪臭、油脂臭等不愉快的气味；异丁醛(VIP=1.14)，呈青香或青草、麦芽香等；乙酸丁酯(VIP=1.84)，呈青草、浆果、甜香、水果气味；辛酸乙酯(VIP=1.45)，呈水果、甜香、梨气味；它们是小曲清香型白酒正常样和醛异味样之间的显著性差异化合物，其中OAV≥1的化合物有乙缩醛、乙醛、正丙醇、乙酸、丁酸、辛酸乙酯、异戊酸、异丁醛、丙酸，在醛异味和正常样品中这9种化合物的OAV对比分析如图2所示。

a-PCA模型；b-OPLS-DA模型图1 醛异味和正常小曲清香型白酒风味物质PCA和OPLS-DA得分图Fig.1 PCA and OPLS-DA scores of aroma compounds in JPXQLO and JPXQLN

从图2可知，在9种OAV≥1的显著差异性化合物中，乙缩醛、乙醛、正丙醇具有最大的OAV，结合它们的气味特征进行分析，可知过量的乙缩醛、乙醛、正丙醇主要表现为青草、过熟的水果气味，过量的脂肪酸呈现酸的、腐臭、脂肪臭气味，综合起来对小曲清香型白酒产生醛异味具有重要影响，主要表现为类似青草、过熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的复合气味，辛酸乙酯主要呈现水果香、甜香，对小曲清香型白酒产生醛异味关联性不大，后期将通过重构试验和添加试验对它们进一步验证。

图2 醛异味和正常小曲清香型白酒中差异性风味物质OAV对比图Fig.2 Comparison of OAV between JPXQLO and JPXQLN

3 结论

本实验采用LLE方法提取小曲清香型白酒的挥发性物质，经GC-O-MS技术进行定性分析，鉴定出61种香气强度大于2的香气化合物；进一步采用HS-SPME/GC-MS以及GC-FID技术进行定量分析并计算OAV。结果表明，小曲清香型白酒正常样和醛异味样品之间的香气组分种类一致，但是共有香气物质的含量存在差异；进一步采用基于香气成分绝对含量的OPLS-DA模型将醛异味样品和正常样品成功区分，并鉴定出OAV≥1且VIP≥1的化合物共9种，为乙缩醛、乙醛、正丙醇、乙酸、丁酸、辛酸乙酯、异戊酸、异丁醛、丙酸。过量的乙缩醛、乙醛、正丙醇主要表现为青草、过熟的水果气味，过量的脂肪酸呈现酸的、腐臭、脂肪臭气味，综合起来主要表现为类似青草、过熟水果、酸的以及脂肪臭的令人不愉快的复合气味，这些化合物的含量与比例关系对小曲清香型白酒产生醛异味具有重要影响。本研究为调控生产工艺，协调小曲清香型白酒的香气，提高小曲清香型白酒的酒质提供了数据指导，也为分析中国白酒异杂味物质来源提供了理论依据与技术思路。