2个蓝莓品种花芽休眠期抗氧化酶活性及内源激素含量动态变化分析*

杨玉春，魏永祥，魏 鑫，刘有春，王兴东，孙 斌，张 舵，刘 成

（1 辽宁省果树科学研究所，营口115009）（2 辽宁省农业科学院大连分院）

多年生植物具有芽休眠的特性，严格意义上来讲它可以分为3个阶段，即进入休眠、内休眠和恢复生长[1-3]。进入休眠是休眠的初级阶段，发生在内休眠之前，通常伴随季节转换、温度降低；内休眠又叫真休眠、自然休眠，这种状态下即便外界环境是有利的，芽同样不能够恢复生长；恢复生长是芽萌动、萌发生长的阶段，这一阶段芽内部生理条件成熟，给予适宜环境芽即能萌发[4]。这3个阶段受植物生命节律严格控制、互相交叉、共同控制着芽的休眠和生长。花芽是果树开花结果最为重要的部位，低温是影响花芽休眠的重要因素之一，一方面低温可以诱导花芽进入休眠，另一方面冷量的累积有利于花芽生理成熟并在合适条件下恢复生长[5-6]。如果需冷量不足，植株就不能正常完成自然休眠全过程，进而引起生长发育障碍，导致花器官畸形或严重败育，影响果树可持续生产[7]。

蓝莓（Vaccinium corymbosumL.）属杜鹃花科越橘属浆果类果树，果实营养丰富，具有增强人体免疫力及保护视力等功效，被联合国粮农组织推荐为第三代水果，是人类五大健康水果之一[8-9]。随着人们生活水平的提高，蓝莓作为一种保健水果需求量迅速扩大，栽培面积不断增加。设施果树栽培是丰富城乡果篮子、节约能源、促进农业产业结构调整的设施产业之一[10-11]。蓝莓温室栽培不仅能够实现反季生产，达到高产、优质、高效的目标，还可以延长蓝莓鲜果供应的货架期，从而达到满足消费者需求、提高蓝莓市场价值、增加种植户收入的目的。目前我国蓝莓温室栽培过程中极易发生需冷量不足的现象，进而导致花芽萌发不整齐、生长结果不良[12-13]。前人虽然针对蓝莓花芽休眠已进行了大量的探索，然而仍有很多问题尚不清楚。已知积累相同冷量恢复正常条件后，需冷量低的蓝莓品种可以很快发芽，而需冷量高的品种则发芽晚，那么直接或间接导致花芽恢复生长差异的因素是什么？解决这一问题可为我们深入研讨蓝莓品种间休眠差异的具体机理奠定生理基础。

为此，笔者以需冷量低、花芽萌发早的蓝莓品种‘斯巴坦’和需冷量高、花芽萌发晚的蓝莓品种‘伯克利’为试验材料（前期筛选获得），探讨了二者在花芽休眠和萌动期间抗氧化酶活性以及内源激素含量的动态变化，以期为今后深入研究蓝莓品种间休眠差异奠定生理基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为北高丛蓝莓品种‘斯巴坦’（Spartan）和‘伯克利’（Berkeley），栽培在辽宁省营口市鲅鱼圈区熊岳镇辽宁省果树科学研究所小浆果研究室试验区，花芽需冷量分别为912、960 h，树龄5 年。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法

于2017 年9 月15 日、10 月1 日、10 月20 日和2018 年1 月5 日4个时间点进行取样（9 月15日至10 月20 日蓝莓花芽处于进入休眠阶段，记为休眠早期，1 月5 日蓝莓花芽刚开始萌发，记为萌动期、恢复生长阶段），选择生长良好成熟枝条的顶端芽50个（含3 次重复），材料收集后立即液氮速冻，-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.2 生理指标测定

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT 法，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用钼酸铵比色法，药品购自苏州科铭生物技术有限公司。内源激素包括脱落酸（ABA）、生长素（IAA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA），其含量的测定委托苏州科铭生物技术有限公司。激素测定方法：称取蓝莓芽组织样品1.0 g，液氮研磨至15 mL 离心管中，加入10 mL 冷却甲醇-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V/V），涡旋2 min，4 ℃提取12 h，浸提液10 000 r/min 离心10 min，吸取1.0 mL 上清液，加入9 mL 水，混匀过Oasis MCX 固相萃取小柱（3 cc/60 mg，美国Waters公司），2 mL 纯水淋洗，最后用1.0 mL 甲醇洗脱，过0.22 μm 滤膜后上机（e2695 液相系统和Quattro Premier XE 三重四极杆串联质谱系统）测定。

1.3 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010 进行统计并作图，采用SPSS 23.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’蓝莓花芽休眠期抗氧化酶活性变化

如图1 所示，‘伯克利’SOD 活性呈先下降后上升的趋势，‘斯巴坦’SOD 活性呈先上升后下降的趋势，在10 月20 日比‘伯克利’高43.0%，差异显著；‘伯克利’CAT 活性呈先上升后下降的趋势，‘斯巴坦’CAT 活性与‘伯克利’变化一致，但总体较平稳，在10 月20 日和1 月5 日，分别比‘伯克利’高72.5%和183.8%，差异均显著。

图1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期抗氧化酶活性变化

2.2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’蓝莓花芽休眠期内源ABA、IAA 含量变化

如图2 所示，‘伯克利’ABA 含量呈先上升后下降的趋势，‘斯巴坦’ABA 含量基本呈上升状态，且始终维持在较低水平，在10 月1 日和10 月20日，分别比‘伯克利’低43.4%和29.3%，差异均显著；‘伯克利’IAA 含量呈先下降后上升再下降的趋势，‘斯巴坦’IAA 含量呈先上升后下降的趋势，且始终维持在较高水平，在10 月20 日和1 月5 日，分别比‘伯克利’高30.7%和107.1%，差异均显著。

图2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期ABA、IAA 含量变化

2.3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’蓝莓花芽休眠期内源JA、SA 含量变化

如图3 所示，‘伯克利’JA 含量呈先上升后下降的趋势，‘斯巴坦’JA 含量呈下降状态，且与‘伯克利’相比下降较快，特别是在10 月1 日和10 月20 日，分别比‘伯克利’低24.5%和29.8%，差异均显著；‘伯克利’SA 含量呈先下降后上升再下降的趋势，‘斯巴坦’SA 含量呈上升状态，但2个品种SA 含量只在9 月15 日时有显著差异，其他取样时期无显著差异。

图3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期JA、SA 含量变化

2.4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’蓝莓花芽休眠期内源激素相关性及比值分析

如表1 所示，‘斯巴坦’蓝莓花芽IAA 与ABA、SA 均呈显著正相关，与JA 呈显著负相关，相关系数分别为0.749、0.849、-0.700；ABA 与JA 呈负相关，但没达到显著，与SA 呈显著正相关，相关系数为0.651；JA 与SA 呈显著负相关，相关系数为-0.606。‘伯克利’蓝莓花芽内源激素相关性较差，仅IAA 与ABA 之间表现出显著正相关，相关系数为0.582，其他激素之间无显著相关性。

表1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期内源激素相关性分析

如图4 所示，‘斯巴坦’ABA/IAA 在整个花芽休眠期间变化较平稳，‘伯克利’ABA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日、1 月5 日分别比‘斯巴坦’高1.7、0.8、1.0 倍，差异均显著；‘斯巴坦’JA/IAA在整个花芽休眠期间总体呈下降趋势，‘伯克利’JA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日分别比‘斯巴坦’高0.9、0.8 倍，差异均显著；‘斯巴坦’JA/SA 在整个花芽休眠期间总体呈下降趋势，‘伯克利’JA/SA在10 月1 日比‘斯巴坦’高0.6 倍，差异显著；‘斯巴坦’SA/IAA 在整个花芽休眠期间变化较平稳，‘伯克利’SA/IAA 在9 月15 日、1 月5 日分别比‘斯巴坦’高0.8、1.0 倍，差异均显著。

图4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期各内源激素之间的比值

3 讨论与结论

植物的芽端分生组织包含一类具有多潜能性的干细胞，它可不断分裂分化产生新的器官原基[14]。休眠意味着分生组织活性静止，这是多年生植物面临外界环境压力时所采取的一种生存策略[15]。研究表明，植物的氧化还原平衡调节植物芽端分生组织活性，直接或间接影响芽休眠，这在其他物种中均有过相关报道，比如马铃薯、葡萄等[16-19]。SOD 可以催化O2-形成H2O2，CAT 则直接清除H2O2。本试验结果表明，在休眠前期‘斯巴坦’蓝莓花芽SOD活性以及萌动期CAT 活性均显著高于‘伯克利’蓝莓，说明‘斯巴坦’蓝莓花芽活性氧代谢效率高，可以快速清除活性氧，即可以在早期将O2-转化成H2O2，并在芽恢复生长阶段通过CAT 快速清除，避免花芽中活性氧累积。反之，‘伯克利’蓝莓花芽SOD 活性虽整体呈上调趋势，但SOD、CAT 活性均比较低，说明‘伯克利’蓝莓花芽活性氧清除能力不足。可见，抗氧化酶活性高可以及时清除活性氧是‘斯巴坦’蓝莓芽恢复生长快速萌发的重要因素之一。

植物激素在诱导和维持芽休眠进程中发挥着重要作用，本试验结果表明，在10 月1—20 日‘伯克利’和‘斯巴坦’蓝莓花芽中ABA、IAA 含量均呈上升趋势，但‘伯克利’花芽中ABA 含量显著高于‘斯巴坦’蓝莓，IAA 含量显著低于‘斯巴坦’蓝莓。通过分析2种激素的比值，可以看出‘伯克利’蓝莓花芽ABA/IAA 显著高于‘斯巴坦’。出现这种情况的原因可能是‘伯克利’蓝莓花芽中ABA含量高阻碍了生长素的流入，以致其IAA 含量低，而对应ABA/IAA 比值高，芽在后期萌发晚。相反‘斯巴坦’蓝莓花芽中ABA 含量低，有利于促生长因子IAA 进入芽，所以ABA/IAA 比值低，芽在后期萌发快。因为，当植物进入休眠时ABA 会诱导胞间连丝闭合阻滞促进生长因子通过胞间连丝进入芽，高水平的ABA 还会限制机体内细胞代谢[20-21]，而生长素是芽恢复生长阶段促进芽生长的重要因子，生长素可以促进细胞增殖、细胞生长、花芽分化[22-23]。本试验还发现，2个蓝莓品种中ABA 与IAA 均呈显著正相关，其中‘斯巴坦’蓝莓ABA 与IAA 相关系数（0.749）更高，‘伯克利’蓝莓中ABA 与IAA 相关系数仅为0.582，意味着导致‘伯克利’蓝莓促生长因子不能有效进入芽的阻遏因素除了ABA 可能还存在其他因素。ABA 与IAA 之间具体的调节关系还需要进一步研究分析。综上所述，‘伯克利’蓝莓需冷量高、花芽萌发晚与花芽中ABA 含量高和IAA 含量低有关。

水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）在花芽休眠过程中同样发挥着重要的功能。本试验结果表明，2个蓝莓品种花芽休眠期间SA 并没有表现出比较明显的差异，具体原因有待进一步分析，但‘斯巴坦’蓝莓JA 降解率和水平均显著低于‘伯克利’。茉莉酸阻滞细胞周期进程，抑制G2/M 期转换，进而抑制细胞分裂[24]，茉莉酸是脂类物质的衍生物，有研究表明此类物质的存在有利于维持芽的休眠[25-26]。本试验结果显示，‘斯巴坦’蓝莓花芽可以快速地下调JA 并维持较低的水平，这表明维持低水平的JA 含量有利于细胞分裂、芽恢复生长。

综上所述，‘伯克利’蓝莓比‘斯巴坦’蓝莓冷量积累多、花芽萌发晚与不能够及时清除活性氧，ABA、JA 含量高，IAA 含量低有关。