miR-138-5p通过调控Survivin表达对食管鳞癌细胞活性的影响

哈斯也提·艾力，妮拉·马哈德，帕力达·帕拉哈提，崔晓宾

食管鳞癌是消化道类恶性疾病，其发生率男性高于女性[1]，食管鳞癌发病因素主要有长期进食热烫食物、烟酒、烟熏、腌制食物、遗传、基因突变等[2]。食管鳞癌的早期病变多限于黏膜，表现为黏膜充血、糜烂，呈斑块儿和乳头状，少见肿块。中晚期肿块逐渐累积增加并凸入腔内穿透食管进入中隔癌细胞[3]。食管鳞癌具有强侵袭、易复发、预后差等特点。相关研究表明，基因分子对食管鳞癌的治疗具有一定的效果。生存素（Survivin）是凋亡抑制因子的一种，且抑制凋亡能力较强，在正常机体中水平较低，在癌症中水平升高，其水平的高低与肿瘤产生及发展联系密切[4]。微小RNA在多种肿瘤的产生及发展中发挥着重要作用，可通过与其靶基因结合进而调控基因的表达，与细胞的增殖、凋亡等联系密切，miR-138-5p是微小RNA之一，已有研究证实[5]miR-138-5p在肺癌中具有一定的作用，过表达的miR-138-5p可抑制肺癌细胞的增殖、并促进肺癌细胞的凋亡。尚未有关报道明确证实其对食管鳞癌细胞具体的作用，因此本文研究miR-138-5p通过调控Survivin的表达对食管鳞癌细胞活性的影响。

1 材料和方法

1.1 一般资料食管鳞癌细胞系EC8733、EC8501、EC109、EC9706细胞来自上海冠导生物公司。收集喀什地区第二人民医院2018年1月至2020年1月食管鳞癌组织及其癌旁组织标本24例；男性14例、女性10例、年龄（55.65±5.18）岁、肿瘤长度＜5 cm、病理分期：T1-T2期9例、T3期15例。所有食管癌患者术前均未接受过放、化疗。清洁级SD大鼠20只，购自长沙天勤生物技术有限公司，鼠龄9～11周，体质量200～300 g，动物许可证号：SCXK（湘）20190018，无菌环境常温饲养，自由饮食饮水，1周后进行实验。本研究经医学伦理委员会获得批准（批号：Y2018-024-05），所有患者及家属均签署知情同意书。

1.2 实验试剂胰蛋白酶（山西利德生物制品有限公司）；Primer 5.0软件（北京中科瑞泰生物科技公司）；CCK-8试剂（武汉卡诺斯科技有限公司）；酶标仪（山东恒美电子科技有限公司）；结晶紫染色液（上海如吉生物科技发挥有限公司）；流式细胞仪（江苏新力科技实业有限公司）；miR-138-5p引物、lipofectamine TM 2000脂质体（百奥迈科生物技术有限公司）。

1.3 细胞培养与分组取食管鳞癌细胞系EC8733、EC8501、EC109、EC9706细胞，运用RPMI 1640培养液培养，36 h后更换培养基。常规条件下培养，取对数期细胞进行试验。

miR-138-5p的转染：将细胞接种于6孔板中培养。直至细胞长到45%～55%时，按说明书操作，用lipofectamine TM 2000转染50 nmol/L相应的miR-138-5p mimics、miR-138-5p-NC，转染培养9 h后，更换新鲜培养液继续培养3 d后即可进行实验。实验分为W组（无转染组）、C组（食管鳞癌细胞转染NC组）、Z组（转染miR-138-5p组）。

1.4 动物实验取20只大鼠，分为食管癌组（注射食管鳞癌细胞）、miR-138-5p组（注射转染miR-138-5p食管鳞癌细胞），每组各10只。各组于右侧前肢腋下注射相应0.5 mL细胞悬液建立移植瘤模型，4 d后肿瘤体积约为100 mm，表示建模成功。

1.5 检测指标

1.5.1 RT-PCR检测Survivin、miR-138-5p水平取W组、C组、Z组食管癌细胞及食管鳞癌组织、癌旁组织标本运用胰蛋白酶消化后提取细胞悬液，冲洗，放于无菌试管中。TRIzol法提取总RNA，Primer5.0软件设计合成引物。将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，PCR反应条件：94℃、4 min;94℃、30 s；58℃、30 s；2℃、30 s。取PCR产物（5 μL）进行电泳分析（琼脂糖凝胶1.5%），以GAPDH为内参，共40个循环，取得到的平均值后得到Ct值，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列，表1。

表1 引物序列

1.5.2 Western blot检测取W组、C组、Z组细胞，裂解液裂解并提取蛋白,并对蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，然后将其煮沸、变性。把电泳后的50 μm蛋白移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1 h。加入1抗后PBS漂洗3次，每次间隔10 min，最后加入2抗对溶液稀释，常温封闭1 h。取出PVDF膜，上述方法漂洗，DAB显色后照相。

1.5.3 Transwell小室测迁移能力取W组、C组、Z组细胞，用DMEM培养液重悬后将细胞悬液（6×104/孔）加入Transwell小室的上室，下室加入1 mL含10%FBS的高糖DMEM培养液。培养72 h后取出小室，PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛溶液固定15 min，用棉签擦去上层细胞，加入0.1%结晶紫染色液染色15 min。自来水冲洗3次，显微镜拍照。实验重复3次。

1.5.4 CCK-8检测食管鳞癌细胞增殖情况取W组、C组、Z组细胞，离心5 min，1250 r/min，制成细胞悬液，接种于96孔板中（4×103个细胞）。分别于细胞贴壁后24、48、72 h加入CCK-8试剂，避光孵育3 h。酶标仪检测450 nm处OD值。

1.5.5 流式细胞仪检测食管鳞癌细胞凋亡情况

取W组、C组、Z组细胞接种于6孔板中，胰酶消化，完全培养基终止；PBS清洗，进行细胞计数，离心5 min、1250 r/min，弃上清，混入500 μLBinding Buffer（结合缓冲液）重悬。加入5 μLAnnexinV-FITC混匀、10 μL PI混匀，常规孵育15 min后，流式细胞仪检测。

1.5.6 双荧光素酶报告基因检测实验将2×105个/孔细胞接种于6孔板中，待细胞生长融合至80%时，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将构建好的Survivin′-UTR-WT和Survivin′-UTR-MUT质粒转染miR-NC（NC组），miR-138-5p mimics（miR-138-5p组）共转染至细胞，按照双试剂盒操作步骤检测各组细胞荧光素酶活性。

1.5.7 观察各组大鼠移植瘤生长情况建模成功4周后处死大鼠，测量肿瘤病灶的长径以及与其垂直的短径，计算瘤体积；同时称瘤质量，计算抑瘤率。

1.6 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行分析，W组、C组、Z组3组食管鳞癌细胞增殖、迁移、Survivin水平等影响的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，计量资料以均数±标准差（±s），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-138-5p、Survivin水平检测结果miR-138-5p在食管癌组织中的表达水平低于癌旁组织（P＜0.05）；Survivin在食管癌组织中的表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），图1。

图1 癌组织组与癌旁组织组miR-138-5p、Survivin水平比较*表示与癌组织组比较（P＜0.05），实验重复3次

miR-138-5p在食管鳞癌细胞系EC9706细胞中表达最低（P＜0.05），且Survivin在食管鳞癌细胞系EC9706细胞中表达最高（P＜0.05），因此选择EC9706细胞进行本次实验，图2。

图2 各细胞中miR-138-5p、Survivin水平表达

miR-138-5p、Survivin在W组与C组中的水平较为接近，组间比较差异无意义（P＞0.05）；在Z组中miR-138-5p的水平有所上升、Survivin水平有所下降，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），由此可看出，miR-138-5p转染成功，图3。

图3 miR-138-5p、Survivin在W组、C组、Z组细胞中的水平与W组比较，P*＜0.05、与C组比较，P#＜0.05，实验重复3次

2.2 Notch1、HIF-1α、MMP-9水平的检测结果W组与C组中Notch1、HIF-1α、MMP-9水平较为接近，组间比较差异无意义（P＞0.05）；与W组、C组比较，Z组中Notch1水平有所升高、HIF-1α、MMP-9水平有所下降，组间比较差异有意义（P＜0.05），见图4。

图4 三组Notch1、HIF-1α、MMP-9水平比较

2.3 食管鳞癌细胞迁移能力W组食管鳞癌细胞迁移数量（282.67±27.65）与C组细胞迁移数量（279.31±28.22）相差较小，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与W组、C组比较，Z组中的迁移数量（76.57±6.71）有所降低，组间比较差异有意义（P＜0.05），图5。

图5 W组、C组、Z组食管鳞癌细胞迁移情况比较与W组比较，P*＜0.05、与C组比较，P#＜0.05，实验重复3次

2.4 食管鳞癌细胞增殖情况W组与C组在24、48、72 h的OD值较为接近，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；Z组在各时间点的OD值均较W组与C组低，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），表2、图6。

表2 三组不同时间点OD值的比较（±s）

表2 三组不同时间点OD值的比较（±s）

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图6 三组食管鳞癌细胞不同时间点OD值比较与W组比较（P*＜0.05）、与C组比较（P#＜0.05），实验重复3次

2.5 食管鳞癌细胞凋亡情况W组食管鳞癌细胞凋亡率（2.47±0.11）%与C组食管鳞癌细胞凋亡率（2.45±0.13）%较为接近，组间比较差异无意义（P＞0.05）；Z组食管鳞癌细胞凋亡率（13.32±1.23）%高于W组与C组，组间比较差异有意义（P＜0.05），见图7。

图7 三组食管鳞癌细胞凋亡情况比较，实验重复3次

2.6 双荧光素酶检测报告结果结果显示Survivin′-UTR-WT在miR-NC组表达水平为（0.79±0.09）、miR-138-5p组表达水平为（0.59±0.07），组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）；Survivin′-UTRMUT在miR-NC组（0.91±0.11）及miR-138-5p组（1.02±0.12）表达无统计学差异（P＞0.05），说明Survivin是miR-138-5p的直接靶点，图8。

图8 荧光素酶报告图

2.7 各组移植瘤生长情况与食管癌组比较，miR-138-5p组大鼠移植瘤的瘤体积、瘤质量降低，抑瘤率升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠移植瘤生长情况（±s）

表3 各组大鼠移植瘤生长情况（±s）

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3 讨论

目前，中国是食管鳞癌的高发地区，发病率位列恶性肿瘤的第四位，且有逐年增长的趋势[6]。威胁患者的生命健康安全，寻求新的食管癌分子靶向治疗方法迫在眉睫，因此本文运用miR-138-5p调控Survivin对食管鳞癌进行治疗，具体分析如下。

在肿瘤的产生与发展过程中，微小RNA通过调节基因的表达，从而调控细胞的生物活性，间接发挥促癌或抑癌的作用，已有研究证实[7]微小RNA在多种肿瘤中参与癌细胞的增殖、迁移等，miR-138-5p是miRNA的 一 种。miR-138-5p可通过 靶 向调控其下游基因进行调控细胞的生物活性，Survivin是miR-138-5p的下游基因之一，可直接作用其上下游分子，对细胞凋亡途径具有抑制作用，在正常机体中水平较低，在癌症中水平升高，其水平的高低与肿瘤的产生与发展密切相关，是抑制细胞凋亡的重要基因之一[8-9]。经本文研究发现在经过转染miR-138-5p模拟物后，miR-138-5p水平有所增加，Survivin水平有所下降。YangR等[10]研究提示，miR-138-5p与Survivin为负相关，miR-138-5p直接识别并结合Survivin mRNA转录，从而抑制Survivin在膀胱癌细胞中的作用，降低癌细胞的增殖与侵袭能力。张志明等[11]对前列腺癌的实验研究中提出，基因敲除SIRT1靶向结合miR-138-5p具有促进癌细胞凋亡的作用。本文研究与上述研究结果相似。且本文荧光酶报告结果、以及动物实验结果表明转染miR-138-5p具有一定的抑瘤作用。

Notch信号通路可调控细胞的分化，根据近年来的研究发现[12-13]，Notchl信号还与肿瘤的产生密切相关，其表达水平的变化还起着抑癌或促癌的作用；有关研究指出[14-15]，当小鼠体内的Notchl被敲除时，小鼠的皮肤发生增殖、基地细胞样癌形成，其原因与Notchl信号通路被激活引起与细胞凋亡相关途径发生改变有关。HIF-1α是一种调控细胞增殖和血管进化相关基因转录的重要因子，在多种肿瘤中均呈现高表达[16]。miRNA具有转录后调控因子水平的作用，多项研究已证实miR-138-5p与HIF-1α具有一定的相关性[17]。肿瘤细胞或周围间质细胞可分泌出MMP，可降解细胞外基质以及细胞间的黏附、促进新生血管生成从而增加癌细胞的活性，MMP-9是金属机制蛋白酶之一，且其与肿瘤的发生发展密切相关[18-19]。miR-138-5p定位于chr16染色体，在多种肿瘤中均为低表达，发挥抑癌作用，对肿瘤细胞的增殖、迁移具有一定的抑制作用[20]。经本文研究表明，经过转染miR-138-5p模拟物后，Notch1水平升高，HIF-1α、MMP-9水平降低。史永亮[21]提示Notch1、Survivin在甲状腺乳头状癌中呈负相关关系，与癌细胞的转移和侵袭联系密切。在王丽萍[22]等对试食管鳞癌的实验中提出，Notch1与食管鳞癌的产生、发展和转移联系密切，可评估食管鳞癌病情的严重程度。赵军华等[23]研究提示，HIF-1α是miR-138-5p的靶基因，在肾癌细胞中miR-138-5p通过靶向调控的表达HIF-1α削弱了癌细胞的增殖、侵袭并抑制了其凋亡。在刘正端等[24]对食管鳞癌细胞研究的实验中发现，MMP-9水平升高，食管鳞癌细胞的侵袭与转移加剧。尚双艳[25]提示Survivin与MMP-9在胃癌中具有正相关关系。本文研究与上述研究结果相似，均认为提高Notch1的表达，降低HIF-1α、MMP-9水平可抑制肿瘤发展，因此本文推测，miR-138-5p通过靶向调控Survivin及HIF-1α的表达间接提高Notch1的水平，抑制了MMP-9表达，从而抑制了食管鳞癌的发展。且CCK8测增殖、Transwell小室测细胞迁移以及流式细胞仪测凋亡结果均可证实上述结论。

综上所述，miR-138-5p可通过降低Survivin的表达，抑制食管鳞癌细胞的增殖及迁移，并促进其凋亡，其作用机制可能与HIF-1α、Notch1及MMP-9表达有关。