成熟期施氮对富士苹果糖含量及相关基因表达的影响

李 凡，魏 桦，戚建国，孙思敏，邹养军，李明军

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)

可溶性糖(主要包括果糖、蔗糖和葡萄糖)是评价果实品质的重要指标，其含量和组成是控制果实甜度与风味的关键，可溶性糖在果实细胞中的大量积累促使果实成熟变甜[1]。可溶性糖的积累受糖代谢转运的高度调控：一方面受胞质中糖代谢利用能力的高度调控[2-3]，如蔗糖磷酸合酶可调控蔗糖的合成能力，己糖激酶和果糖激酶可调控葡萄糖和蔗糖的含量[3-4]；另一方面受定位于液泡膜的糖转运蛋白的高度调控，如液泡糖转运蛋白(TST)控制着西瓜[5]、甜菜[6]糖的含量等。同时，果实中的糖含量也受环境和栽培技术的显著影响，如氮肥施用过量会导致果实糖含量降低，果实风味变淡[7-8]。近年来，对植物细胞中糖的代谢转运途径已经有了全面认识，但对栽培和管理技术影响糖代谢和转运能力进而调控果实糖含量的机制尚不清楚。探明施氮等管理技术对果实中糖含量的调控机制，既是果实品质改良的基础，也对栽培技术改良和科学管理有重要意义。

作为果树必需的营养元素，氮素对树体营养和生殖生长、生理生化过程有着重要影响[9-10]。不同时期施氮对果树生长发育和果实品质的影响不同，陕西省苹果园基肥中氮肥用量占施氮总量的71.5%，追肥仅占施氮总量的28.5%[11]，生产中常因氮肥施用不当而影响果实的含糖量[12-13]。研究表明，施氮不足会降低苹果叶片的碳同化能力，改变糖代谢，降低山梨醇、蔗糖、果糖和葡萄糖含量[14]；高氮则不利于果实糖的积累，尤其在成熟期施用氮肥会降低苹果等果实的含糖量[13]。但对氮肥如何影响果实中的可溶性糖含量、组成及其代谢和转运尚不清楚。为此，本试验以陕西杨凌地区栽培的富士苹果(Malusdomestica)为材料，研究成熟期施氮对苹果果实可溶性糖含量及糖代谢和转运相关基因表达量的影响，以期为科学施用氮肥和调控果实品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2016年9-10月在陕西省杨凌示范区五泉镇绛中村农户果园进行，其地理位置为东经107°97′，北纬34°29′，属大陆性季风气候，年均气温12.9 ℃，无霜期211 d，年均日照时数2 163.8 h，年均降水量635.1 mm，土壤为土娄土。

1.2 试验仪器及试剂

1.2.1 仪 器 TP-A1000电子天平(精确到0.01 g)，华志科学仪器有限公司；XMTD-8222烘箱，上海精宏实验设备有限公司；BJ-150自动研磨仪，拜杰公司；Auto Analyzer 3-AA3连续流动分析仪，SEAL公司；PAL-1手持式数显糖度计，ATAGO公司；A11 basic S025型液氮冷冻研磨机，IKA公司；API 2000液相色谱质谱联用仪，AB Sciex公司；iQ5.0定量PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.2.2 试 剂 主要包括H2SO4、体积分数30% H2O2、甲醇、核糖醇、甲氧、CTAB、Tris、EDTA-2Na·2H2O等，均为分析纯试剂。

1.3 试验设计

在试验地农户果园中，选取长势基本一致、无病虫害的15年生富士果树12株，彼此之间互不相邻。试验设置施氮和对照2组处理，每组6株树。施氮处理是以尿素(陕西渭河重化工有限责任公司产品)为氮源，于成熟期(09-19)在每株果树环状施肥沟内均匀施入尿素1 kg，施肥后立即浇水并覆土，施肥沟距离果树1.5 m；对照不施氮肥，只浇灌与施氮处理相同水量并覆土。试验期间果树不再施肥，其他管理按照当地果园生产规范统一进行。

于试验处理后6，13，20 d，选择无病虫害、无裂果、大小基本一致的苹果，每株树随机采取10个，分装标记后带回实验室。其中6个果实切碎后放入液氮速冻，-80 ℃保存备用；另外4个果实进行含水量、全氮和可溶性固形物含量测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 果实可溶性固形物含量 每株树取2个鲜果，用榨汁钳压榨取汁，采用手持式数显糖度计测定可溶性固形物含量，单株作为1次重复，结果取平均值。

1.4.2 果实含水量 每株树取2个鲜果用电子天平称取质量后，切薄片并置于厚信封中，于105 ℃烘箱杀青30 min，80 ℃烘至恒质量，再次称质量并计算果实含水量。单株为1次重复，结果取平均值。

1.4.3 果实全氮含量 将1.4.2节中烘干的施氮处理和对照样品分别混合，采用自动研磨仪粉碎后过0.25 mm筛。称取0.30 g粉末，采用H2SO4-H2O2消解法[15]制成待测液，用AA3连续流动分析仪测定全氮含量。重复3次，结果取平均值。

1.4.4 果实糖酸含量 将各处理苹果速冻样品分别混合，采用液氮冷冻研磨机粉碎，取0.10 g粉末，参考Zhang等[16]的方法，以体积分数75%甲醇和400 mg/L核糖醇为提取液，5 mg/mL甲氧为延伸液进行提取，利用液相色谱质谱联用仪测定并计算果糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇和苹果酸含量，各可溶性糖含量相加得到总糖含量，总糖与苹果酸含量的比值为糖酸比。重复3次，结果取平均值。

1.4.5 果实糖代谢及转运相关基因的表达 称取0.20 g施氮处理和对照果实速冻样品，采用改良CTAB法[17]提取苹果总RNA，以SYBR®Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(TaKaRa)试剂盒进行反转录，用Primer 5.0设计基因特异引物(表1)，定量PCR仪进行荧光定量测定。

表1 供试的qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR analyses

qRT-PCR的体系为20 μL，其中SYBR 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，52 ℃低温退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以对照处理为标准，用2-ΔΔCt法计算施氮处理果实液泡膜糖转运蛋白基因(MdTST1、MdTST2)、蔗糖磷酸合成酶基因(MdSPS1、MdSPS6)、果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)的相对表达量。重复3次，结果取平均值。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2010统计分析试验数据，用SPSS Statistics 16.0分析差异显著性(P<0.05)，采用Microsoft Excel 2010制图。

2 结果与分析

2.1 成熟期施氮对苹果氮含量的影响

成熟期施氮对富士苹果果实氮含量的影响如图1所示。

图柱上标不同小写字母表示同一采样时间不同处理间差异显著(P<0.05)，下图同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at same sampling time (P<0.05).The same below

图1显示，与对照相比，成熟期树体根施尿素后，富士苹果含氮量显著增加。处理后6，13，20 d，对照组果实氮含量分别为3.76，3.26，3.51 mg/g，施氮处理果实氮含量分别显著增加了27.35%，34.90%和13.72%。

2.2 成熟期施氮对苹果可溶性固形物含量及含水量的影响

可溶性固形物含量是评价苹果果实品质的重要指标。图2显示，与对照相比，在施氮处理后6，13，20 d，富士苹果可溶性固形物分别显著降低1.03%，1.20%和0.72%。为了进一步确定可溶性固形物含量的降低与果实含水量的关系，图2还分析了施氮对含水量的影响。由图2可以看出，施氮对苹果果实的含水量无显著影响。上述结果表明，成熟期施用氮肥后苹果可溶性固形物含量的降低并不是果实含水量的变化所致。

图2 成熟期施氮对苹果可溶性固形物含量及含水量的影响Fig.2 Effects of nitrogen application on the soluble solids and water content of apple in ripening period

2.3 成熟期施氮对苹果主要糖酸含量的影响

果实中的糖酸含量和组成不仅直接影响可溶性固形物含量，也会影响果实的风味品质。图3显示，与对照相比，成熟期施氮可显著影响富士苹果主要糖酸含量和组成，果实中果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量几乎均显著降低，而蔗糖和苹果酸含量均显著增加。与对照相比，施氮处理6 d后，苹果果糖、葡萄糖和山梨醇含量分别显著降低了23.12%，10.11%和34.64%，蔗糖和苹果酸含量分别显著增加了70.22%和71.73%；施氮处理13 d后，果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量分别显著降低了13.71%，13.06%，14.24%和32.08%，蔗糖和苹果酸分别显著增加11.47%和34.92%；施氮处理20 d后，果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量分别显著降低了12.07%，28.38%，31.47%和25.91%，蔗糖和苹果酸含量则分别显著增加22.76%和48.37%。

图3 成熟期施氮对苹果主要糖酸含量的影响Fig.3 Effects of nitrogen application on main sugar and acid contents of apple in ripening period

从图4可以看出，与对照相比，成熟期施氮苹果的总糖含量和糖酸比显著降低，施氮后6，13，20 d其含量分别降低了11.59%，11.12%，15.01%和48.52%，34.13%，42.72%。

图4 成熟期施氮对苹果总糖含量和糖酸比的影响Fig.4 Effects of nitrogen application on total sugar content and sugar-acid ratio of apple in ripening period

以上结果表明，成熟期施氮可使富士苹果果糖、葡萄糖、半乳糖等己糖含量降低，苹果酸含量提高，从而影响了果实的可溶性固形物含量和风味，导致果实品质下降。

2.4 成熟期施氮对苹果糖代谢和转运相关基因表达的影响

图5～8显示，与对照相比，成熟期施氮对苹果部分糖代谢和转运基因表达具有较大影响。与对照相比，施氮处理富士果实液泡膜糖转运蛋白基因(MdTST1、MdTST2)表达量总体降低，其中MdTST1表达量在施氮后20 d显著低于对照，下调了75%；MdTST2表达量在施氮后6，13，20 d均显著下调近50%，导致果糖、葡萄糖、半乳糖等在液泡中的积累减少。与对照相比，施氮处理蔗糖磷酸合成酶基因MdSPS1、MdSPS6表达量增加，其中在处理20 d后分别上调了247%和404%，故果实中的蔗糖含量有所升高。果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)的表达量在施氮后6，13，20 d均显著高于对照，其中MdFK2表达量在施氮后20 d上调303%，MdFK4表达量在施氮后6 d上调399%，MdHK1表达量在施氮后6，20 d上调150%左右，因果糖、葡萄糖被磷酸化，故其含量降低。

图5 成熟期施氮对苹果液泡膜糖转运蛋白基因相对表达量的影响Fig.5 Effects of nitrogen application on relative expression of tonoplast sugar transporter genes in ripening period

图6 成熟期施氮对苹果蔗糖磷酸合成酶基因相对表达量的影响Fig.6 Effects of nitrogen application on relative expression of sucrose phosphate synthase genes in ripening period

图7 成熟期施氮对苹果果糖激酶基因相对表达量的影响Fig.7 Effects of nitrogen application on relative expression of fructokinase genes in ripening period

图8 成熟期施氮对苹果己糖激酶基因相对表达量的影响Fig.8 Effects of nitrogen application on relative expression of hexokinase genes in ripening period

3 讨 论

苹果可溶性糖含量不仅与遗传特性相关，也受施肥管理等因素的影响[18-19]。氮素作为果树生长发育的必需元素，与果实糖含量密切相关，适期、适量施氮有利于提高果实的产量与品质。曾艳娟[20]研究表明，施用氮肥能提高苹果树枝、叶、果的全氮含量，且全氮含量与施氮量呈正相关。本试验中，与对照相比，成熟期施氮后果实氮素含量也显著增加。但Quartieri等[21]的研究表明，采收前对果树进行有限氮供应后树体氮素贮藏增加，而果实含氮量增加不显著。这与以上结果存在差异，可能与氮肥施用量和果树品种不同有关。

在果实成熟过程中，果实的可溶性固形物含量呈逐渐增加趋势[22]。彭福田[23]研究表明，苹果可溶性糖含量以不施氮处理最高，高氮处理(1.0 kg/株)较低。而曾艳娟[20]发现，当施氮量为0.2 kg/株时，果实可溶性固形物含量较不施氮处理提高了1.7%。本试验结果表明，与对照相比，成熟期施氮后苹果可溶性固形物含量显著降低，但果实含水量并无显著变化，说明可溶性固形物含量降低并非果实中水的稀释作用所致。可溶性固形物的主要成分是可溶性糖，因此其含量降低与果实中可溶性糖含量变化相关。富士苹果作为己糖积累型果实，成熟期以积累果糖和葡萄糖为主，蔗糖次之[24]，半乳糖和山梨醇含量较低。本研究发现，与对照相比，成熟期施氮苹果果实中的果糖、葡萄糖、半乳糖及山梨醇含量均明显降低，蔗糖含量明显增加，这与魏建梅等[24]的研究结果相近。陈磊等[25]的研究也表明，成熟期高氮处理后丰水梨果实葡萄糖和果糖含量显著下降，蔗糖含量迅速上升，但山梨醇含量变化不显著，这可能是富士苹果与丰水梨的属间差异所致。本研究还发现，与对照相比，成熟期施氮后果实总糖含量显著降低，尤其是甜度最高的果糖含量显著下降，从而导致果实甜度降低；同时苹果酸含量显著增加，从而导致糖酸比降低，果实风味品质下降。这与彭福田[23]在红富士上的研究结论相一致。但丁宁等[26]的研究却发现，晚秋叶面追氮可以提高矮化苹果果实可溶性固形物、可溶性糖含量和糖酸比，显著改善果实品质。分析以上差异的原因，可能与施肥方法的差异或本试验中氮肥施用过量有关。

苹果果实可溶性糖含量受糖代谢和转运相关基因的调控。糖主要在液泡中积累，液泡膜糖转运蛋白负责糖在液泡和胞质间的转运[27]。成熟期苹果液泡膜糖转运蛋白高度表达，将果糖、葡萄糖等已糖由胞质向液泡运输，其部分家族成员还可运输蔗糖[28]。果糖激酶和己糖激酶会催化果糖和葡萄糖进行磷酸化，生成果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解途径和氧化戊糖磷酸途径，也可用于淀粉合成[29]。本研究发现，与对照相比，成熟期施氮处理后，富士苹果液泡膜糖转运蛋白基因MdTST1、MdTST2表达量降低，果糖、葡萄糖在液泡中的积累受到抑制；同时，果糖激酶基因MdFK2、MdFK4和己糖激酶基因MdHK1的表达量均显著上调，促进了果糖、葡萄糖的转化；MdSPS1、MdSPS6表达量上调，蔗糖含量随之增加，果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸可以作为底物在蔗糖磷酸合酶的催化下生成蔗糖。说明成熟期施氮后果实的糖代谢和转运相关基因表达量发生了变化，表现为己糖含量降低，蔗糖含量增加，从而改变了果实可溶性糖的组成。

4 结 论

对成熟期富士苹果进行施氮处理后，苹果氮素含量显著增加，果实中蔗糖磷酸合成酶基因(MdSPS1、MdSPS6)、果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)表达量几乎均显著上调，液泡膜糖转运蛋白基因(MdTST1、MdTST2)表达量总体下调，总糖含量和可溶性固形物含量均显著降低；同时，施氮处理后果实中的苹果酸含量显著提高，糖酸比显著降低，从而导致果实品质下降，因此苹果成熟期采果前不宜施氮。