黑米灌浆特性对花青素积累的影响

赵 霞，刘然方

(1 宜宾学院 香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000；2 自贡农业科学研究所，四川 自贡 643000)

有色稻是指其糙米(颖果)由于花青素在果皮内的累积而呈现出不同于白米色泽的水稻，花青素在种皮中的积累可使颖果呈现出绿色、黄褐色、咖啡色、褐色、红色、红褐色、紫红色、紫黑色、乌黑色等颜色，市面上的有色稻米以黑米、红米等为主[1-2]。其中黑米营养价值较高，需求也最大。黑米在中国、印度等东南亚国家种植历史悠久，全球62%左右的黑米产自中国，其中云南、贵州、四川、陕西、湖南、江西、广西等省均有一定规模的黑米种植[2-3]。黑米花青素具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等保健作用及药用价值，也可用于天然食用色素的提取，具有较大的开发利用价值。花青素沉积也是影响黑米外观成色的重要因素，直接影响着其经济价值[4-6]。

花青素又称为花色素(anthocyanin)，是一种黄酮类次生代谢物[7]。黑米中的花青素的主要种类为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside)和芍药素-3-O-葡萄糖苷(peonidin-3-O-glucoside)，总花青素含量一般达4.95～47.37 mg/kg[8-10]。黑米花青素通过苯丙烷类代谢途径进行生物合成，该生物合成受多种酶调控，主要有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3β-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、无色花青素还原酶(LAR)、花青素还原酶(ANR)、糖基转移酶(UGT)和花色素苷合成酶(ANS)[11-14]。糖和激素作为信号物质，协同调控花青素的合成与积累[15-17]。

有研究指出，水稻强势粒和弱势粒异步发育与灌浆现象明显，且存在较大的品种间差异[18]。黑米花青素沉积发生于籽粒灌浆期，基本与籽粒灌浆发育同步[19]。随着灌浆的推进，颖果的远胚端最早沉积花青素，逐渐延伸到胚端并使整个果皮着色[20-21]。柳敏等[21]研究了有色稻籽粒花青素的积累动态，但未分析灌浆特性对花青素积累的影响。目前有关籽粒灌浆特性对花青素合成与积累的影响研究较少，有限的理论基础限制了提高黑米花青素的栽培技术研究及品种选育。黑米花青素积累易受光照、温度以及生长纬度等环境因素的影响[21-22]，且存在着色不均匀、外观成色较差等问题。为此，本研究以籽粒花青素含量具有显著差异的5个黑米品种为材料进行盆栽试验，探索黑米籽粒灌浆特性对花青素积累的影响，分析黑米花青素积累的内在生理调控机制，以期为高花青素黑米品种的选育及栽培技术研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

籽粒花青素含量具有显著差异的5份黑米材料BR1、BR2、BR3、BR4和BR5，由中国水稻研究所提供。

1.2 试验设计

试验在四川宜宾学院农场(28°80′29″N，104°62′26″E)进行。于2018年进行预试验，2019年进行正式试验。2019年3月15日播种，采用大田湿润育秧，待5～6叶(4月22日)时移栽于塑料桶(桶高30 cm、直径34 cm)。盆栽用土为稻田黏壤土，经晒干粉碎过筛，每桶定量装干土15 kg。每桶种2 穴，每穴4 株。试验采用完全随机设计，每个品种为1个处理，种植15桶，重复3次。采用自然光照和温度，肥料和水分管理同大田常规管理。采用点颖与挂牌相结合的方法精确标记颖花的开颖日期，对于不同粒位籽粒分开标记，具体参照朱庆森等[23]的方法：以前2 d开花，着生于穗顶部的一次枝梗的籽粒为强势粒；以后2 d开花，着生于穗基部的二次枝梗的籽粒为弱势粒。花后每隔5 d取各品种强势粒和弱势粒样品，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 灌浆分析 取强势粒和弱势粒，于80 ℃烘箱处理48 h，待质量恒定后脱去颖壳称质量，以单粒质量表示灌浆程度。参照朱庆森等[23]的方法，用 Richards方程进行拟合。

W=A(1+Be-kt)-1/N。

式中：W为粒质量(g)，A为生长终值量，B为初值参数，k为生长速率参数，t为灌浆时间(d)，N为形状参数的倒数。

根据Richard方程初始参数A、B、k、N计算次级参数最大灌浆速率出现时间(Tmax·G)、最大灌浆速率(Gmax)、平均灌浆速率(G)、活跃生长期(D)、有效灌浆期(t3)。对上述Richards方程求一阶导数，可得灌浆速率(GR，即单位时间粒质量的增长量，g/d)依时间t变化的灌浆速率方程：GR=dW/dt=AkBe-kt/(N(1+Be-kt)(1+N)/N)，根据灌浆速率方程绘制灌浆速率曲线。

1.3.2 颖果形态观察 取强势粒和弱势粒，手工脱去颖壳(要保证籽粒的完整性)，随机选取有代表性的2粒颖果进行观察，并用数码相机拍摄颖果形态特征。在灌浆初期，由于部分品种籽粒未形成，无法完成有效取样。

1.3.3 花青素含量测定 取强势粒和弱势粒，于80 ℃烘箱中处理48 h，待质量恒定后脱去颖壳，按照农业行业标准NY/T 832-2004和柳敏等[21]的方法测定总花青素含量。因色素在酸性条件下提取较快，本试验用乙醇与HCl混合液提取花青素，混合液中乙醇含量为50%，HCl为8%。取强、弱势粒各0.2 g，放入15 mL混合提取液中，80 ℃水浴浸取30 min，冷却后用分光光度计测定浸取液OD535值，重复检测2次，以OD535=1时的色素浓度为1个花色素单位，用每1 000粒种子中所含的花色素单位(U)表示花色素含量。

用以下公式计算花青素积累速率：

花青素积累速率=最高花青素含量/最高花青素含量出现时间(花后时间,d)。

1.3.4 产量及农艺性状分析 待黑米成熟后，每个重复收获6穴(12株)，晾晒干后脱粒计产、考种。其中有效分蘖率=单株有效穗数/单株最高分蘖数。

1.4 数据处理

采用Excel软件进行数据整理，用SPSS 22.0软件进行统计分析，统计方法采用方差分析和相关分析，用LSD法(P<0.05)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同黑米品种的籽粒灌浆特性

采用Richards方程对5种黑米籽粒灌浆过程进行拟合，结果如图1所示。

图1 不同品种黑米籽粒干物质积累的动态曲线Fig.1 Dry matter accumulation of kernel for black rice varieties

由图1可以看出，不同黑米品种强势粒与弱势粒的拟合度均在0.996～0.999，说明不同粒位的籽粒灌浆过程均可用Richards模型来描述。图1显示，随着灌浆进程的推进，5个黑米品种籽粒质量均呈“S”型增长，花后前5 d黑米粒质量增长缓慢，5 d后粒质量呈指数增长，灌浆后期粒质量增长又趋于缓慢，直到停止增长。在整个生长时期，BR1、BR2、BR3、BR5的强势粒粒质量均高于弱势粒，BR4在灌浆结束时强势粒与弱势粒粒质量基本相等，表明该品种灌浆物质较为充足, 弱势粒也得到了较好的充实。

由图2可以看出，5个黑米品种的灌浆速率均表现为随着灌浆进程先快速增加，达到峰值后迅速降低。其中BR2和BR4强势粒的灌浆速率峰值显著高于弱势粒，而BR1、BR3、BR5灌浆速率峰值在强弱势粒间差异不明显。相对于品种BR2、BR4，BR1、BR3、BR5的灌浆速率峰值较低，但曲线更宽，有效灌浆时间更长。5个黑米品种强势粒灌浆速率的变化时间均显著早于弱势粒，说明5个黑米品种均属于异步灌浆类型。

图2 不同品种黑米籽粒的灌浆速率曲线Fig.2 Grain filling rate of black rice varieties

由表1可以看出，5个黑米品种强势粒最大灌浆速率出现的时间较弱势粒早2～5 d，最大灌浆速率出现时间在品种间差异较大，强势粒变幅为4.42 d，弱势粒变幅为5.82 d,以BR2强势粒最早，BR5弱势粒最迟。各黑米品种强势粒最大灌浆速率、平均灌浆速率均高于弱势粒，其中以BR2和BR4强势粒的最大灌浆速率和平均灌浆速率较高，且强弱势粒间差异最大。活跃生长期在各品种间差异较大，变幅为10.65 d。平均灌浆速率越高的品种，活跃生长期和有效灌浆期越短，相对于BR1、BR3、BR5 3个品种，BR2和BR4的活跃生长期和有效灌浆期均较短。

表1 不同品种黑米籽粒灌浆特征参数的比较Table 1 Comparison of grain filling parameters of different black rice varieties

表1(续) Continued table 1

2.2 不同黑米品种颖果形态的比较

从图3可以看出，不同黑米品种籽粒发育初期果皮呈绿色，颖果远胚端最早沉积花青素，并由两端逐渐延伸到颖果果皮中央，从而使整个果皮着色。颖果果皮花青素沉积不均匀，其中腹侧着色较浅，背部维管束处着色相对较深；果皮颜色在品种间差异明显，同时果皮着色时间存在明显的品种和粒位间差异。

图3 不同品种黑米强势粒和弱势粒的发育动态Fig.3 Caryopsis growth of superior and inferior grains in different black rice varieties

2.3 不同黑米品种花青素积累动态

从图4可以看出，5个黑米品种籽粒的花青素含量均随时间推移先缓慢增加再快速增加，达到峰值后于灌浆后期又有所降低。其中BR1和BR2的花青素含量均较高，其次为BR3和BR4，而BR5的花青素含量最低。花青素积累活跃期存在明显的品种间差异，其中BR1于花后15 d前花青素积累较少，花后15～25 d快速积累；BR2、BR3、BR4和BR5花青素的积累活跃期分别为花后5～20，10～25，5～15和5～25 d。不同品种强、弱势粒花青素积累动态均有明显差异，灌浆前中期强势粒花青素含量明显高于弱势粒，但灌浆中后期弱势粒花青素含量高于强势粒，且灌浆后期其花青素降解速率明显缓于强势粒。花后30 d时，5个黑米品种弱势粒花青素含量均高于强势粒，且花青素含量越高的品种粒位间差异越大，其中BR1和BR2强、弱势粒的差异最大。

图4 不同品种黑米籽粒花青素的积累动态Fig.4 Accumulation of anthocyanin in kernel for black rice varieties

2.4 黑米籽粒花青素积累速率与灌浆特征参数的相关性

由表2可以看出，黑米籽粒花青素积累达到峰值前的积累速率与最大灌浆速率、平均灌浆速率均呈显著正相关关系，而与活跃生长期、有效灌浆期、最大灌浆速率出现时间无显著相关关系。

表2 黑米籽粒花青素积累速率与灌浆参数的相关性Table 2 Correlation between anthocyanin accumulation rate and grain filling rate in grain of black rice

2.5 不同黑米品种产量及其农艺性状的比较

由表3可以看出，5个黑米品种的产量及其农艺性状均存在显著的品种间差异。BR2和BR4的单株产量差异不显著,但均显著高于其他3个品种；BR2和BR4 2个品种间千粒质量、穗长差异显著，且均显著高于其他品种；BR3单株产量、结实率、每穗粒数、单株有效穗数均显著低于其他品种，但其有效分蘖率最大。

表3 5个黑米品种产量及其农艺性状的比较Table 3 Comparison of the yield and agronomic characters of 5 black rice materials

3 讨 论

3.1 黑米籽粒的灌浆特征

灌浆是籽粒形成的重要生理过程，也是粒质量、产量和品质的决定性因素。对籽粒灌浆特性进行研究时，通常根据籽粒在穗部的着生部位及开花时间分为强势粒和弱势粒，着生在稻穗中上部的籽粒，开花早、灌浆快、充实好、粒质量大，称之为强势粒；着生在稻穗下部的籽粒，开花迟、灌浆慢、充实差、粒质量小，称之为弱势粒[24]。根据强、弱势粒灌浆时间的差异，可分为同步灌浆和异步灌浆。杨建昌[25]认为，水稻强、弱势粒异步灌浆现象明显，且以大穗型品种表现得尤为突出，弱势粒充实差和粒质量低，不仅阻碍了水稻产量潜力的发挥, 而且还会降低稻米品质，尤其是加工品质和外观品质。目前国内外对影响籽粒灌浆的主要因素进行了大量研究，认为影响籽粒灌浆的主要生理因素有光合同化物的供应限制、激素间不平衡、蔗糖-淀粉代谢途径关键酶活性或基因表达量低、“流”不畅、库限制等[25-26]。本研究结果表明，5个黑米品种粒质量的变化曲线均呈“S”型，且均表现为花后前5 d粒质量增长缓慢，5 d后粒质量呈指数增长，灌浆后期粒质量增长又趋于缓慢，直到停止增长，其灌浆规律与普通白米水稻相似[21，23]。柳敏等[21]研究指出，有色稻颖果的生长、胚乳发育与常规水稻品种基本相同。5个黑米品种强、弱势粒异步灌浆明显，强势粒最大灌浆速率出现时间较弱势粒早2～5 d，强势粒最大灌浆速率和平均灌浆速率均高于弱势粒。BR1、BR2、BR3、BR5品种整个生长期强势粒粒质量均高于弱势粒，只有BR4灌浆结束时强势粒与弱势粒粒质量基本相同，表明BR4的灌浆物质较为充足，弱势粒也得到了较好的充实，故其产量最高。另外，5个黑米品种的灌浆特性存在明显的品种间差异，相对于BR1、BR3、BR5 3个品种，BR2和BR4的平均灌浆速率较高，但活跃生长期较短。

3.2 黑米籽粒花青素积累的动态特征及与灌浆特征的相关性

本研究表明，5种黑米籽粒发育初期果皮均呈绿色，籽粒远胚端最早沉积花青素，并由两端逐渐延伸到颖果果皮中央，进而使整个果皮着色。黑米果皮花青素沉积不均匀，以腹侧着色较浅，背部维管束处着色相对较深。这与韩磊等[19]的研究结果一致。从花青素含量的动态变化可以看出，黑米花青素的沉积与籽粒灌浆基本同步。前人研究表明，黑米在授精后3 d果皮开始沉积花青素，授精后5～6 d花青素迅速增加，7 d后花青素充满整个颖果皮，花后20 d花青素积累停止[19]。本研究也得到相似结论，但多个品种间的比较试验表明，花青素积累动态特征存在明显的品种间差异，如BR1花后15 d前花青素积累较少，于花后15～25 d快速积累，而BR2花青素积累活跃期为花后5～20 d，BR3为花后10～25 d，BR4为花后5～15 d，BR5为花后5～25 d。随着灌浆进程的推进，5个黑米品种的花青素含量均在灌浆后期达到最高值后又开始表现出下降趋势， BR3花后30 d的果皮颜色显著浅于花后25 d。Shao等[20]研究指出，水稻成熟期总花青素含量及花青素组分矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside)和芍药素-3-O-葡萄糖苷(Peonidin-3-O-glucoside)含量均显著低于花后21 d。花青素的降低，可能是由于灌浆后期糖类等有机物供应不足，淀粉等物质积累与花青素竞争葡萄糖，导致花青素中的糖苷键断裂而表现为无色化合物，也可能是水稻熟化脱水过程中花青素有所降解所致，其具体生理机制还有待于进一步研究。

水稻强势粒和弱势粒异步发育与灌浆现象明显[18]，黑米籽粒花青素积累发生于水稻灌浆期，并且花色苷和淀粉均以蔗糖、戊糖、己糖等糖类为合成原料[8]，两者关系密切。黑米强、弱势粒花青素积累动态存在显著差异，灌浆前中期强势粒花青素含量明显高于弱势粒。本研究对籽粒花青素含量达到峰值前的花青素积累速率与籽粒灌浆特征参数进行相关分析，结果表明，花青素积累速率与平均灌浆速率、最大灌浆速率均呈显著正相关关系，与活跃生长期、有效灌浆期、最大灌浆速率出现时间无显著相关关系。综上可知，黑米灌浆前中期籽粒质量的快速增加与花青素的快速积累基本同步，且速率呈正相关；灌浆中后期弱势粒花青素积累量显著高于强势粒，花青素降解速率明显缓于强势粒。至花后30 d，5个黑米品种弱势粒花青素含量均高于强势粒，且花青素含量越高的品种，粒位间差异越大，其中BR1和BR2强、弱势粒的差异均达到极显著水平。杨建昌[25]认为，强、弱势粒间存在显著的灌浆生理差异，且机理复杂，主要差异在于同化物供应、激素代谢、蔗糖-淀粉代谢的不同。拟南芥、小麦等植物体内的蔗糖、麦芽糖及其水解产物果糖、葡萄糖均可作为糖信号、能量物质或结构物质促进花青素的生物合成与积累[15]；激素脱落酸、细胞分裂素、茉莉酸可促进拟南芥、小麦等植物花青素的合成与积累，赤霉素会抑制拟南芥叶片花青素的合成，同时糖和激素作为信号物质可协同调控花青素的合成与积累[16-17]。由此推断，强、弱势粒的灌浆生理差异可能是导致其花青素积累动态差异的主要内部因素。花青素合成除了受品种遗传特性和内部灌浆生理的影响外，还易受光照强度、光质、温度等外部环境因素的影响[27]，弱势粒花青素的积累优势和降解速率较缓也可能与穗下部位置的光照、温度等小环境相关，但其具体原因及其生理机制还需进一步研究。目前关于籽粒灌浆发育对花青素合成与积累影响的生理机制了解甚少，开展相关研究可进一步丰富对黑米花青素生理调控机制的认识，从而为黑米花青素的调控提供参考。

4 结 论

黑米强、弱势粒异步灌浆明显，强势粒最大灌浆速率出现时间早于弱势粒，强势粒最大灌浆速率和平均灌浆速率均高于弱势粒。花青素积累发生于籽粒灌浆期，随着灌浆进程的推进，单粒花青素含量均呈先增后降趋势；至灌浆中后期，弱势粒表现出较高的花青素积累优势，花青素含量越高的品种，粒位间差异越大。花青素积累与籽粒灌浆特性密切相关，灌浆前中期花青素的快速积累与籽粒质量增加基本同步，且与平均灌浆速率和最大灌浆速率呈显著正相关。