臭椿酮对植物种子萌发及相关生理生化指标的影响

田岐震, 魏少鹏,2, 姬志勤*,,2

(1. 西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2. 陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西 杨凌 712100)

臭椿Ailanthus altissima是原产于东亚的苦木科臭椿属植物，其根皮和果实为传统中药[1]。迄今为止，已从臭椿中分离鉴定了数十个苦木苦味素类化合物，这些化合物表现出抗病毒、抗肿瘤、抗疟及抗菌等多种药理活性[2-4]。1959年，Mergen首次报道臭椿提取物具有除草活性[5]；1995年，臭椿提取物中的除草活性成分被分离鉴定为臭椿酮[6]。2003年，De Feo等对臭椿根皮中的除草活性成分进行了系统分离，从中得到臭椿酮、ailanthinone、chaparrine和ailanthinol B 4个具有除草活性的苦木苦味素类化合物，其中臭椿酮的活性最强[7]。2011年，Pedersini等比较了臭椿茎皮不同溶剂提取物的除草活性，发现其活性与臭椿酮的浓度呈正相关[8]。Heisey等报道了臭椿提取物对17种杂草的田间防除效果，发现提取物对其中13种供试杂草具有很好的防效[9]。2019年，Demasi等研究了臭椿酮苗前土壤处理防治杂草的田间持效期，发现其在低有机质含量土壤中的持效期可达20～30 d，但在高有机质含量土壤中的降解较快[10]。近年来，国内外对臭椿酮 (或臭椿提取物)的除草活性进行了较多的研究，证明臭椿酮具有开发成植物源除草剂的潜在价值，然而有关臭椿酮除草作用机制的研究鲜有报道。本研究测定了臭椿酮对植物种子萌发及相关生理生化指标的影响，旨在为进一步研究臭椿酮的除草作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试药剂及植物

臭椿酮 (ailanthone，纯度95%，CAS: 981-15-7)，本课题组从臭椿根皮中分离得到[11]。

油菜Brassica napus、小麦Triticum aestivum、马齿苋Portulaca oleracea、苘麻Abutilon theophrasti、稗草Echinochloa crusgalli、反枝苋Amaranthus retroflexus、狗尾草Setaria viridis及马唐Digitaria sanguinalis，以上供试作物及杂草的种子均采自西北农林大学北校区农场。

1.2 种子萌发活性测定

采用平皿法测定臭椿酮对8种供试植物种子萌发的影响[7]。先用少量二甲基亚砜溶解臭椿酮，再用体积分数0.1%的Tween 80分别稀释成1.56、3.13、6.25、12.50、25.00和50.00 μg/mL 的供试溶液，二甲基亚砜在所有供试溶液中的最终体积分数不超过0.5%。先用体积分数1%的次氯酸钠溶液对种子进行表面消毒，再用去离子水冲洗3次。将50粒种子均匀地放在培养皿 (9 cm) 的滤纸上，每个培养皿中加入5.0 mL上述臭椿酮供试溶液。以含体积分数0.5%的二甲基亚砜和0.1% Tween 80的水溶液作为溶剂对照。种子在25 ℃、16 h/8 h (光/暗) 条件下培养4 d。分别于24、48、72和96 h记录萌发种子的数量 (以根长2 mm为萌发标准)。所有试验重复3次。

1.3 种子吸水量测定

参照文献方法进行[12]。在铺有双层滤纸的培养皿 (9 cm) 中分别加入5.0 mL质量浓度为1.56、3.13、6.25、12.50和25.00 μg/mL 的臭椿酮溶液，分别放入油菜 (1.0 g) 和小麦 (2.0 g) 种子，在25 ℃恒温条件下分别培养4、8、12和16 h。将种子从溶液中取出，吸干水分，称重，计算吸水量 (最终质量减去初始质量)。以含体积分数为0.5%的二甲基亚砜和0.1%的Tween 80的水溶液作为溶剂对照。每个处理重复3次，计算平均值。

1.4 幼苗生长的生理生化指标的测定

根据预试验确定臭椿酮抑制幼苗生长中浓度。将萌发的油菜和小麦种子分别置于0.50 μg/mL和2.00 μg/mL臭椿酮溶液中，在25 ℃的光照培养箱中培养 (光/暗 = 12 h/12 h)。以含体积分数为0.5%的二甲基亚砜和0.1%的Tween 80的水溶液作为溶剂对照。当对照组种子胚芽长到约1.0 cm时，分别收集胚芽和胚根 (各0.50 g)，置于预冷的研钵中，加入0.05 mol/L预冷的磷酸盐缓冲液1.0 mL (pH 7.8)，然后将胚芽和胚根在冰上磨成粉末，分别提取超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、过氧化物酶 (POD) 和总可溶性蛋白(TSP)[13]。当对照组种子胚芽长到约1.0 cm时，分别收集胚芽和胚根 (0.10 g)，加入蒸馏水5～10 mL，煮沸30 min，提取两次，提取液过滤入25.00 mL容量瓶，用蒸馏水定容，提取总可溶性糖 (TSS)[14]。所有粗提液于4 ℃保存备用。

采用氮蓝四唑光还原法[14]测定SOD活性；采用愈创木酚法[14]测定POD活性；采用高锰酸钾滴定法[14]测定CAT活性；采用3,5-二硝基水杨酸法[14]、考马斯蓝G-250染色法[14]分别测定TSS和TSP含量。每处理重复3次。

1.5 对植物细胞有丝分裂的影响

参照文献方法进行[15]。将油菜种子置于含水滤纸上培养，待根长为1.0 cm时，挑选生长一致的幼苗移至质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.50和1.00 μg/mL的臭椿酮溶液中继续培养24 h。取根尖0.5 cm部分，浸入卡诺氏固定液中固定6 h。取出根尖用去离子水冲洗至无醋酸气味，接着将根尖浸入1 mol/L的盐酸溶液，在60 ℃下孵育10 min。取出根尖用去离子水洗涤3次，置于载玻片上，用接种针将根尖捣碎，加入卡宝品红染色10 min。放上盖玻片，用铅笔轻轻敲击，使细胞均匀分布。光学显微镜下进行观察和计数。有丝分裂指数和畸形指数分别按公式 (1) 和 (2)计算。

式中：A，有丝分裂指数；C，分裂细胞数；D，顶端分生组织细胞总数；B，畸形指数；E，分裂异常数。

1.6 活性氧含量的测定

参考文献方法[16]并略作修改。将油菜种子置于含水滤纸上催芽，待根长为1.0 cm时，挑选长势相近的油菜幼苗，浸入0.10、1.00和10.00 μg/mL的臭椿酮溶液，于25 ℃黑暗培养12 h。以体积分数为0.1%的二甲基亚砜溶液作为溶剂对照。每个处理设3个重复。将幼苗分别转置于3,3-二氨基联苯胺 (DAB) 染色液和氯化硝基四氮唑蓝 (NBT)染色液中，于25 ℃黑暗培养箱中浸染2 h。取出幼苗观察拍照，用Image J软件进行量化处理。按公式（3）计算染色强度。

式中：R，染色强度；F，未染色根尖灰度值；H，染色根尖灰度值。

1.7 细胞死亡率测定

参考文献方法[15]并略作修改。将油菜种子置于含水滤纸上催芽，待根长为1.0 cm时，挑选长势相近的油菜幼苗，浸入0.10、1.00和10.00 μg/mL的臭椿酮溶液。以体积分数为0.1%二甲基亚砜溶液为对照，于28 ℃黑暗培养24、48和72 h，幼苗煮沸30 min作为死亡对照，将整株油菜浸入2.50 μg/mL的伊文思蓝水溶液中，于旋转摇床上25 ℃孵育30min，取出植株用去离子水洗涤，除去未结合的染料，并观察拍照。每处理重复3次。运用Image J对照片进行量化处理。按公式(4)计算细胞相对死亡率。

式中：X，细胞相对死亡率；M，0.1%二甲基亚砜组灰度值；L，处理组灰度值；K，CK组灰度值；Z，煮沸对照组灰度值。

1.8 数据处理

采用SPSS 23.0软件计算臭椿酮对种子萌发抑制IC50值，使用邓肯氏新复极差法 (P< 0.05) 进行差异显著性分析；使用Image J量化处理染色强度；使用Excel 2010完成图表绘制；使用Photoshop 6.0处理图片。

2 结果与讨论

2.1 臭椿酮对8种植物种子萌发的影响

从表1可以看出，臭椿酮对油菜、稗草、苘麻、狗尾草和马唐的种子萌发具有较强的抑制作用，其IC50值分别为3.74、9.86、9.71、3.87和3.76 μg/mL。臭椿酮对小麦和反枝苋种子萌发也有较强的抑制作用，其IC50值分别为24.70和32.60 μg/mL。在供试浓度下，臭椿酮对马齿苋种子萌发的抑制作用较弱。从结果可以看出，臭椿酮的除草活性在单子叶和双子叶植物间无选择性，但是个别杂草对臭椿酮的敏感性较低。臭椿酮对油菜和小麦的种子萌发有明显抑制作用，有文献也报道了臭椿提取物在采用茎叶喷雾法防治杂草时对番茄、白萝卜、黄豆、向日葵、玉米、燕麦和南瓜有严重的药害[9]，因此不建议将其用于大田作物及蔬菜生产中，但在园艺作物中作为一种非选择性除草剂具有潜在的应用价值，相关应用技术值得进一步研究。

表1 臭椿酮对8种植物种子萌发的影响Table 1 Effects of ailanthone on seed germination of eight plants

2.2 臭椿酮对油菜和小麦种子吸水量的影响

萌发是种子从静止干燥状态到代谢活跃状态，然后生长成幼苗的过程[17]。这一过程始于干燥种子对水分的吸收，外源化合物可以抑制种子蛋白酶的活性，造成种子吸水能力下降，最终导致种子不能正常萌发[12,18]。臭椿酮处理后的油菜和小麦种子吸水量如图1所示。可以看出，不同浓度臭椿酮处理的种子在吸水能力上并无明显差异，与空白对照相比也没有显著差异，这说明臭椿酮并未影响种子的吸水能力，由此可以推测臭椿酮不影响种子蛋白酶的活性。

2.3 臭椿酮对幼苗生长的影响

SOD在保护细胞免受超氧化物自由基损伤方面发挥重要作用，它催化超氧化物自由基的降解生成过氧化氢[19]。细胞内过氧化氢水平受多种酶调控，CAT是多酶体系中的一种[20]。POD是植物中的抗氧化酶，通过将过氧化氢还原为水来催化多种底物的氧化[21]。SOD、CAT和POD活性的增加是植物组织提高抗氧化能力的表现。

对油菜和小麦胚芽和胚根中SOD、CAT和POD的酶活性测定结果 (图2) 表明：溶剂对照处理油菜胚根SOD活性为106.27 U/g, 臭椿酮处理后SOD活性增加至173.56 U/g。同样，用臭椿酮处理后，小麦胚芽中SOD活性从1 851.43 U/g增加到2 159.61 U/g，小麦胚根中SOD活性从167.50 U/g 增加到441.54 U/g。臭椿酮也导致了CAT活性的轻微增加，小麦胚芽和胚根的CAT活性值从1.79 mg/(g∙min)增加到2.20 mg/(g∙min)，胚根的CAT活性值从0.41 mg/(g∙min)增加到0.56 mg/(g∙min)；处理过的油菜和小麦幼苗POD活性也高于对照组。

与对照组相比，臭椿酮提高了油菜和小麦胚中TSS和TSP的含量，说明低剂量的臭椿酮能提高植物的整体代谢水平。

活性氧 (ROS) 的产生和消除是一个动态平衡，在植物体内活性氧的消除主要依赖于细胞的抗氧化酶系，当细胞内产生的活性氧增加时，为维持细胞的正常生长，植物会提高抗氧化酶活性消除活性氧[22]。上述生理指标试验证实臭椿酮的存在可以提高植物的抗氧化能力，但臭椿酮是否会诱导ROS的积累仍需通过活性氧染色试验进行探究。

2.4 臭椿酮对细胞有丝分裂的影响

通过对油菜根分生组织细胞的有丝分裂指数分析，评价了臭椿酮对油菜根分生组织细胞分裂的影响。暴露于臭椿酮 (0.01、0.05、0.10、0.50和1.00 μg/mL) 24 h后，较高浓度的臭椿酮 (0.50和1.00 μg/mL) 明显抑制了油菜根的生长 (图3 Ⅰ)，其中1.00 μg/mL的臭椿酮抑制率为40.60%。处理组根尖分生区有丝分裂指数均低于对照组，且臭椿酮对油菜细胞分裂的抑制作用呈剂量依赖性 (图3 Ⅱ)。暴露于1.00 μg/mL的臭椿酮后，有丝分裂指数仅为0.48%，而对照组为5.85%。此外，臭椿酮还能导致畸形细胞的形成，其中0.10 μg/mL的臭椿酮处理后畸形指数最高，约为0.45% (图3 Ⅱ、Ⅲ)。

2.5 臭椿酮对植物组织中活性氧积累的影响

活性氧是植物进行代谢的副产物，在生长发育过程中可以作为信号分子参与调控，但是活性氧的过度积累会导致脂质过氧化反应，从而对植物的生长造成严重的损伤[23]。植物体内的活性氧主要包括超氧阴离子 (O2−)、过氧化氢 (H2O2) 和羟基自由基 (•OH) 等。

由图4可以看出，油菜根浸入臭椿酮后，不仅根长受到了抑制，根部的活性氧含量也大幅升高，且其含量随着臭椿酮质量浓度的增加而升高，在10.00 μg/mL臭椿酮剂量下，油菜根长几乎没有增长，但是过氧化氢和超氧阴离子含量分别是溶剂对照的2.53倍和2.08倍。由试验结果得知，臭椿酮的存在可以在短时间内诱导植物体内大量活性氧的累积。抗氧化酶活性测定结果表明，在臭椿酮的影响下，SOD、CAT和POD的活性都呈升高的趋势，这与臭椿酮可以在短时间内诱导大量活性氧积累相关，体内活性氧含量升高会损害细胞正常生命活性，机体便会调节抗氧化酶的活性来消除活性氧。

2.6 细胞死亡率测定

通过图5 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ) 可以看出，染色较深的是根毛茂盛部位和根尖，对根尖区域的相对死亡率测定发现，在臭椿酮相同质量浓度下，根尖细胞的相对死亡率并没有随着时间的推移而产生较大变化。1.00 μg/mL臭椿酮处理24、48和72 h的细胞相对死亡率分别为8.56%、9.58%和10.23%，但是，在同一时间段，根尖细胞相对死亡率会随着臭椿酮质量浓度的增加而增大，0.10、1.00和10.00 μg/mL臭椿酮处理72 h时的细胞相对死亡率分别为6.01%、10.23%和21.36%。表明1.00 μg/mL臭椿酮在24 h内就已经造成细胞死亡，但是直至72 h细胞死亡的数量并没有显著增加，说明受到臭椿酮影响失去活力的细胞占根尖细胞的比例变化不大。细胞有丝分裂周期为G1、S、G2和M4个时期，在外部条件相同的情况下，处于一个时期的细胞数量几乎不变，例如，处于M期的细胞占细胞总数5%～10%[24]。结合根尖分生区有丝分裂现象观察，可以推测：臭椿酮的存在可以引起部分植物根尖分生区细胞死亡，使这一部分细胞无法进入M期，或进入M期后引起有丝分裂畸形，从而减少新生细胞数量，导致根无法正常生长。

3 结论

臭椿酮对多种植物的种子萌发和幼苗生长具有很强的抑制作用，且在单子叶和双子叶植物之间没有选择性。臭椿酮对植物种子吸水能力无明显影响。植物生长量的减少可能与臭椿酮抑制其细胞分裂有关。SOD、CAT和POD的酶活试验结果表明，臭椿酮提高了植物的抗氧化能力。DAB和NBT染色结果表明，臭椿酮诱导了植物组织中活性氧的积累，伊文思蓝染色说明臭椿酮可以引起一部分细胞死亡，但并未随着时间的推移而增长，推测臭椿酮的存在可以引起部分植物根尖分生区细胞死亡，并使这一部分细胞是无法进入细胞有丝分裂的M期，或进入M期后会引起有丝分裂畸形，从而减少新生细胞数量，导致植物根系无法正常生长。本研究结果表明，臭椿酮表现出较强抑制种子萌发和幼苗生长活性，究其原因可能为活性氧积累，或引起了部分植物根尖分生区细胞死亡使其无法正常有丝分裂。