八月瓜籽营养成分及对毛木耳菌丝生长的影响

钟娟，梁光焰，汪建文，胡华林，孙超

1. 贵州师范学院生物科学学院（贵阳 550018）；2. 贵州医科大学，省部共建药物植物功效与利用国家重点实验室/贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室（贵阳 550014）；3. 贵州科学院（贵阳 550001）

八月瓜（Akebia trifoliata）学名三叶木通，又称羊开口、八月炸、野香蕉等，分布于海拔300～2100 m，气候温和湿润的山林地带，在我国贵州、云南、四川、湖南等地都有生长，其中以贵州铜仁、云南昭通、四川雅安、湖南张家界居多[1]。八月瓜是一种营养丰富食药两用水果，富含矿物元素、三萜类皂苷、维生素C、氨基酸、甾醇、有机酸、可溶性糖等[2-5]，素有“保健果王”之称。八月瓜中药名为预知子，具有抗菌消炎、活血止痛、抗肿瘤、抗抑郁等功能[6-8]。

八月瓜肉质鲜嫩、甘甜可口，但其种籽较多，平均含籽约200颗/果。对八月瓜籽的脂肪酸、氨基酸成分及抗氧化、抗肿瘤活性等已开展研究。周瑜等[9]研究发现不同种源预知子籽油的脂肪酸组成及含量存在差异。欧阳玉祝等[10]用气相色谱-质谱联用仪（GCMS）测定八月瓜籽油脂肪酸组成与含量，结果发现其主要为油酸（40.93%）和棕榈酸（30.08%）。谢小霞等[11]和彭涤非等[12]在研究长江流域地区预知子籽油的脂肪酸组成时发现预知子籽油具备开发成新的营养保健油的潜力。史卿等[13]从八月瓜籽中获得含17种氨基酸的蛋白质。欧阳玉祝等[10]比较八月瓜籽油与VE、异VC-Na、BHT和芝麻油的自由基清除能力，结果表明八月瓜籽油的还原能力、H2O2和超氧阴离子自由基清除能力最强。Lu等[14]和任红艳等[15]研究表明八月瓜提取物对抑制肝癌细胞增长具有显著功效，尤其是八月瓜籽。然而，针对黔产八月瓜籽的营养成分、化学组成等鲜有报道，特别是，还未见八月瓜籽油在农业领域的应用。

毛木耳营养丰富，味美可口，具有抗癌、清肺、益气、止痛活血等功效。因此，试验以黔中引种八月瓜籽为原料，采用超声提取法提取籽油，全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸的种类及质量分数，GC-MS法测定挥发性物质的化学组成，进而探究八月瓜籽油及其挥发性成分对毛木耳菌丝生长的影响，以期为八月瓜籽油的应用拓宽领域，进而为八月瓜籽资源的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

八月瓜籽（龙里县恒远生态农业专业合作社）；毛木耳菌种（贵州省生物研究所）；棕榈酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（上海麦克林生化科技有限公司）；PDA培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；氨基酸混合标准液、柠檬酸-柠檬酸锂缓冲液的氢氧化锂再生液（德国Sykam公司）。

1.2 主要仪器与设备

HP6890/5975C型GC-MS联用仪（Agilent）；HP-5MS型弹性石英毛细管柱（Agilent）；S433D型全自动氨基酸分析仪，LCAK 06/Na型阳离子分析（Sykam）；AG 285型十万分之一天平（Mettler Toledo）；Millipore-0026型超纯水（Millipore）；N-1100型旋转蒸发仪（Eyela）；微量移液枪（Sartorius）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；DL SB-5/20型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 八月瓜籽油的制备

参照杨辉等[16]的八月瓜籽油超声提取法而稍作修改。准确称取15.00 g干燥八月瓜籽粉末于250 mL锥形瓶中，加入料液比1∶11（g/mL）的石油醚为提取溶剂，在超声功率60%，温度60 ℃下超声50 min，超声提取3次，每次间隔30 min，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩后得八月瓜籽油，按式（1）计算出油率，试验3次取出油率平均值为42.39%。

式中：y为出油率，%；m1为样品中油质量，g；m2为八月瓜籽粉末质量，g。

1.3.2 八月瓜籽油的甲酯化

参考欧阳玉祝等[17]所述甲酯化法进行。将0.5 g籽油置于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL浓硫酸-甲醇溶液（1∶99，V/V），在水浴锅上70 ℃加热回流60 min后，加入10 mL正己烷和20 mL蒸馏水，摇匀静置，取上清液，添加无水硫酸钠干燥，即得待用。

1.3.3 游离氨基酸的测定

供试品溶液制备：分别称取3.00 g去油前后八月瓜籽粉末置100 mL量瓶中，加入浓度为0.02 mol/L盐酸30 mL，搅拌15 min，静置20 min，按4000 r/min离心10 min，上清液置于100 mL量瓶中，残渣加25 mL水搅拌3min，离心，重复2次，合并上清液定容于100 mL，过0.45 μm有机微孔滤膜，即得。

色谱条件：色谱柱为LCAK07/Li型标准分析阳离子型交换树脂；双通道检测波长，其中440 nm通道检测脯氨酸，570 nm通道检测其他所有氨基酸；输液泵压力范围0～4.2 MPa；洗脱泵流速0.45 mL/min，茚三酮衍生泵流速0.25 mL/min；进样量50 μL；分离柱温度37 ℃，反应器温度130 ℃。

标准溶液的配制、梯度洗脱条件等可参照文献[18]。记录各色谱峰面积，计算八月瓜籽油各游离氨基酸质量分数。

1.3.4 GC-MS分析

采用GC-MS法分析八月瓜籽油挥发性物质的化学组成。

GC条件：色谱柱为ZB-5MSI型弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 μm×250 μm）。柱温于48 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至206 ℃，以10 ℃/min升至310 ℃，运行58 min；汽化室温度250 ℃；载气为氦气（99.999%），载气流量1.0 mL/min，按分流比20∶1进样，溶剂延迟时间4.0 min。

MS条件：离子源为EI源，温度230 ℃；电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，倍增器电压1482 V，发射电流34.6 μA，质量范围29～500 amu。

甲酯化八月瓜籽油样品用正己烷稀释，取1 μL溶液进样。各峰与标准图谱库Nist05和Wiley275比对，确定其挥发性物质的组成，用峰面积归一化法计算各挥发性物质化学组成成分的相对质量分数。

1.3.5 生物活性评价

1.3.5.1 供试药剂溶液配备

将八月瓜籽油及其主要挥发性成分溶于无菌水中，加入与药剂等体积的吐温-80配制成“母液”，根据各药剂的试验需求进一步稀释。试验使用药剂质量浓度范围分别为0.2000～0.0125μg/mL（液体）和1.000～0.0625 μg/mL（固体）。

1.3.5.2 菌种的活化

选取无污染的毛木耳菌种于超净工作台中接种菌丝至含PDA培养基的培养皿中，倒置于相对湿度60%～65%、温度24±51 ℃，光周期L∶D=12 h∶12 h的培养箱中培养，重复3次，待菌丝即将长满整个培养皿时终止培养，备用。

1.3.5.3 含药PDA培养基的制备

待PDA培养基冷却至45～50 ℃时，用移液枪于超净工作台中吸取一定量的1.3.5.1溶液，加入培养基中，摇匀后直接倒入直径9 cm的培养皿中，每个药剂5个浓度，每皿20 mL，静置冷却，备用。

1.3.5.4 生物活性测定

选取生长均一、正圆形的菌落，用打孔器在超净工作台中沿边缘顺序打成直径r为7 mm的菌碟，用接种环挑取菌碟接入1.3.5.3所述培养基中央，重复3次，对照为加入吐温-80无菌水的PDA培养基。倒置于24±1 ℃培养箱中培养，每隔24 h观察菌丝生长情况，并采用十字垂直交叉法通过游标卡尺测定菌落直径R，待任何一组菌丝生长到接近培养皿边缘时即终止培养。

1.4 数据处理

菌丝纯生长量、菌丝抑制率和生长速率按式（2）计算。

采用SPSS 19.0统计软件中的One-way ANOVA进行处理，并运用LSD法对各处理及对照进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸分析

八月瓜籽去油前后各游离氨基酸检测数据见表1。未去油八月瓜籽中含有氨基酸27种，其中γ-氨基丁酸质量分数最高，其次是精氨酸；总氨基酸质量分数（T）为0.1802%，其中必需氨基酸质量分数（E）为0.0562%，E/T比值达31.19%；人体必需氨基酸达8种，早产儿必需氨基酸4种，分别为精氨酸、牛磺酸、胱氨酸、酪氨酸；小儿生长发育期间的必需氨基酸1种，即组氨酸。

表1 八月瓜籽去油前后游离氨基酸检测结果

去油后八月瓜籽中含有氨基酸28种，其中γ-氨基丁酸质量分数最高，其次是精氨酸；T为0.4737%，高于八月瓜果皮和果肉[4]，其中E为0.1264%，E/T比值达26.68%；与去油前八月瓜籽中人体必需氨基酸、早产儿必需氨基酸和小儿生长发育期间的必需氨基酸种类完全一致，具有巨大资源再利用价值。

表2为八月瓜籽中味觉氨基酸组成及质量分数检测结果。由表2可知，未去油八月瓜籽中甜味氨基酸[19]质量分数为0.0390%，其中丙氨酸质量分数最高，为0.0258%；药用氨基酸[20]质量分数为0.0895%，其中精氨酸质量分数最高，为0.0299%；鲜味氨基酸[21]质量分数为0.0625%，芳香味氨基酸[22]质量分数为0.0189%。去油后八月瓜籽中甜味氨基酸质量分数为0.0843%，其中丙氨酸质量分数最高，为0.0499%；药用氨基酸质量分数为0.1947%，与八月瓜果皮基本一致[4]，其中精氨酸质量分数最高，为0.0589%；鲜味氨基酸质量分数为0.1395%，芳香味氨基酸质量分数为0.0310%。

表2 八月瓜籽中味觉氨基酸的组成及质量分数

2.2 挥发性物质的化学组成

甲酯化八月瓜籽油挥发性物质化学组成的总离子流图见图1，化学组成分析结果见表3。甲酯化八月瓜籽油中共检测出8种挥发性物质，其相对质量分数占总离子峰的99.58%，其中反亚油酸甲酯相对质量分数最高，为27.45%，其次是7-十八烯酸甲酯（27.42%），棕榈酸甲酯、油酸甲酯和硬脂酸甲酯的相对质量分数依次为21.86%，17.43%和3.75%，这5种挥发物的质量分数占总离子峰的97.91%，是甲酯化八月瓜籽油中的主要挥发性物质。

表3 挥发性物质的化学组成分析结果

图1 甲酯化八月瓜籽油挥发性物质化学组成的总离子流图

2.3 4种药剂对毛木耳菌丝生长的影响

利用甲酯化八月瓜籽油挥发性物质化学组成分析结果，选取相对质量分数高、市场易得的3种主要挥发性物质和八月瓜籽油对毛木耳菌丝生长进行生物活性评价。

2.3.1 4种药剂对毛木耳菌丝的抑制作用

由表4可知，在预设药剂浓度范围内，八月瓜籽油（质量浓度为0.025～0.100 μL/mL）对毛木耳菌丝生长有一定的抑制作用，最大抑制率为15.03%，而高或低浓度均对菌丝生长有促进作用，低浓度促进率为9.8%，高于高浓度的1.97%；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在预设浓度内均对菌丝生长有抑制作用，且硬脂酸甲酯在0.125 μg/mL浓度下有最大抑制率，其值为23.96%；棕榈酸甲酯在预设浓度内则体现高浓度促进低浓度抑制菌丝生长的作用。

表4 4种药剂对毛木耳菌丝的抑制作用

2.3.2 4种药剂对毛木耳菌丝生长速率的影响

由表5可知，在预设药剂浓度范围内，培养基中添加八月瓜籽油对毛木耳的生长具有一定的抑制作用，与对照相比，其质量浓度为0.100和0.050 μg/mL时可显著影响菌丝生长；油酸甲酯和硬脂酸甲酯在预设浓度内均可抑制菌丝的生长，其中油酸甲酯各浓度对菌丝生长影响不显著，但硬脂酸甲酯0.125 μg/mL质量浓度下生长速率最小，其值为4.06±0.07 mm/d，与对照相比影响显著；棕榈酸甲酯在预设浓度内则表现高浓度促进低浓度抑制菌丝的生长，其低浓度生长速率与对照相比表现出显著的抑制性。

表5 4种药剂对毛木耳菌丝生长速率的影响

3 结论

氨基酸是构成蛋白质的基本物质，可通过代谢合成抗体、激素和肌酸等人体必需物质；脂肪酸是机体主要能量来源之一，可帮助人体活动补充必要的营养物质。八月瓜籽中不饱和脂肪酸含量较高，氨基酸种类丰富、含量较高，尤其是人体必需氨基酸和药用氨基酸，被广泛应用于在医药、保健品、食品等领域，具有很高的开发利用价值。

试验以黔中引种八月瓜籽为原料，采用超声提取法提取籽油，全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸的种类及质量分数，GC-MS法测定挥发性物质的化学组成，进而探究八月瓜籽油及其挥发性成分对毛木耳菌丝生长的影响。结果表明，去油后八月瓜籽含有28种氨基酸，总氨基酸质量分数（T）为0.4737%，其中8种必需氨基酸总量（E）为0.1264%，E/T比值达26.68%；鲜味、甜味、芳香味和药用氨基酸质量分数分别为0.1395%，0.0843%，0.0310%和0.1947%。甲酯化八月瓜籽油共检测出8种挥发性物质，其中反亚油酸甲酯质量分数最高，其次是7-十八烯酸甲酯。4种药剂中，以棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯对毛木耳菌丝生长的影响最大，其在0.1250 μg/mL质量浓度下，抑制率和生长速率均有最小值，且与对照相比影响显著。试验结果可为八月瓜籽榨油后残渣资源再利用、籽油综合开发利用提供数据支撑。