浙江省浆蜂种蜂场蜜蜂病虫害检测分析

马敏彪，施金虎，王 帅，郑火青

(1.浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站，浙江 杭州 310021； 2.浙江大学动物科学学院)

1 养蜂概况

养蜂业是浙江省的一个特色产业，在促进农民增收、农业发展和乡村振兴中发挥重要作用，浆蜂养殖量和蜂产业总产值一直稳居全国第一[1]。浙江省现有饲养蜂群140万群，其中浆蜂(西方蜜蜂)100万群，中华蜜蜂40万群[1]。

相比于本土的中华蜜蜂，浆蜂生产力更强，产品种类更加丰富，产业链更加完整[2]。虽然意蜂生产力较优，但其在饲养过程中也面临更严峻的病虫害威胁[3]。因此，蜂种的抗病力直接决定了蜂群的健康程度，进而影响其生产力和蜂场的经济效益。目前，意蜂上常见的病虫害包括蜂螨、微孢子虫等寄生虫以及病毒等病原体[4-5]，它们间的协同作用也被认为是近年来世界范围内蜂群大量损失的诱发因子[6-7]，引起了行业的广泛关注。

蜂螨，主要为狄斯瓦螨(俗称大蜂螨)，是蜜蜂的一种体外寄生螨，主要以吸食蜜蜂体液为生，不仅直接对蜜蜂生理造成损害，缩减蜜蜂寿命，而其作为多种病原的载体，与其他病原(如病毒和微孢子虫)间的协同作用更是影响了整个蜂群的健康[3,6-7]。微孢子虫作为蜜蜂肠道的专性寄生虫，对蜜蜂消化系统影响显著，其也会与蜂螨和病毒产生协同作用从而降低蜂群的健康态势[6]。目前，已经报道和确认的蜜蜂病毒超过30种[8]，而其中国内常见的蜜蜂病毒主要有黑蜂王台病毒(Black queen cell virus, BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus, CBPV)、残翅病毒(Deformed wing virus, DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)和囊状幼虫病毒(Sacbrood virus, SBV)等5种[9]，且多数以隐性感染的状态存在，直到有其他诱发因子(如寄生虫感染)造成显性症状[10]。本文通过对浙江省内主要6家浆蜂种蜂场蜜蜂对蜂螨(本文主要指狄斯瓦螨)、微孢子虫和5种常见病毒等抗病力指标的测定，以期为浆蜂种质资源的管理和利用提供参考，并为后续的蜜蜂相关育种以及蜜蜂病虫害防控等工作提供一定的借鉴。

2 材料与方法

2.1测试蜂群 从萧山、淳安、长兴、绍兴、兰溪、江山等6县市6家种蜂场，每家蜂场选取群势相近的5个蜂群作为测试蜂群，于2019年9月18日运到位于杭州市临安区的浙江省种畜禽质量检测中心。测试蜂群到达后统一换用提前准备的新箱，随机交替放置在测试场地，并编号，由专人统一负责饲养管理。

2.2测定指标 分别于2019年12月13日和2020年3月11日对每个蜂群取样进行抗病力测定，测定指标包括蜂螨寄生率、微孢子虫孢子数和主要病毒感染率和感染滴度。

2.2.1蜂螨寄生率 从每个蜂群的隔板和外侧巢脾上分别取50只成年蜜蜂工蜂，冷冻麻痹后检查每只蜜蜂体上的蜂螨个数，计算所检查到的蜂螨总数与检查蜜蜂总数的百分比分别获得两个取样点的蜂螨寄生率，两个取样点的值取平均后得到该群蜜蜂的蜂螨寄生率。同时为了保证蜂群安全越冬，在越冬期间对每个蜂群均进行治螨处理。同时检测蜂群在越冬期的治螨效果，在越冬期间对每个蜂群均进行治螨处理。

2.2.2微孢子虫孢子数 从每个蜂群的隔板和外侧巢脾上分别取15只成年蜜蜂工蜂，剪下30只蜜蜂的腹部，加入30 mL纯净水，充分研磨；充分混匀后吸取10 μL研磨液滴于血球计数板中间，在10×40倍显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下进行微孢子虫孢子计数，每个蜂群重复3次，最后取平均值计算出各蜂群内平均每只蜜蜂体内的微孢子虫孢子数。

2.2.3病毒感染率和感染滴度 从每个蜂群的隔板和外侧巢脾上各取15只成年蜜蜂工蜂，每群共30只蜜蜂，用液氮冷冻后充分研磨，取100 mg的粉末通过RNA提取试剂盒(Aidlab, Beijing, China)进行总RNA提取，经ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix反转录试剂盒(TOYOBO, Osaka, Japan)得到cDNA，最后利用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix荧光定量PCR试剂(TOYOBO, Osaka, Japan)检测蜜蜂常见的5种病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率和感染滴度。病毒的绝对定量采用浙江大学蜂学实验室根据早先相应病毒构建质粒所获得的标准曲线，公式分别如下：YBQCV=-3.1935X+38.743,R2=0.9971；YCBPV=-3.3271X+45.973,R2=0.9907；YDWV=-3.3213X+40.914,R2=0.9997；YIAPV=-3.2646X+38.918,R2=0.9955；YSBV=-3.3639X+48.458,R2=0.9938(其中Y为检测得到的CT值，X为病毒的log拷贝数，10Xcopies为病毒感染滴度)。

2.3统计分析 对本研究中蜂群成蜂数量、子脾数量、微孢子虫孢子数和病毒感染滴度通过单因素方差分析(one-way ANOVA)来进行统计分析，并选用单因素方差分析中的Tukey法进行多重比较。对蜂螨侵染率和病毒感染率采用卡方检验(Chi-square test)进行分析。统计分析均使用SPSS 20.0软件(IBM, Armonk, USA)进行，且当P值小于0.05时即认为差异显著。

3 检测结果

3.1蜂群进场时基本情况 测试蜂群进场当天的基本情况见表1。30个蜂群除萧山种蜂场的4个蜂群有11张巢脾外，其余所有蜂群均为10张巢脾。每群的蜂量和子脾数在不同蜂场间差异较大，萧山、兰溪、绍兴、长兴蜂场，蜂群巢脾基本相称，其中萧山蜂场因巢脾数更多，蜂量和子脾数都明显多于其它蜂场；淳安蜂场蜂群略少于脾；而江山蜂场蜂量明显不足，子脾数也明显少于其它蜂场的蜂群。

总体而言，各蜂场内部蜂群之间在成蜂数量和子脾数上无显著差异(P>0.05)，而在进场时，蜂场间无论是成蜂数量(P<0.001)还是子脾数量(P<0.001)上差异均显著，等到越冬期和春繁期时，各蜂场间蜂群群势已无明显区别(图1)。

表1 测试蜂群进场时的基本情况

图1 不同时间段各地区种蜂场的成蜂量(A)和子脾数(B)情况

3.2蜂螨寄生率 越冬期(2019年12月)各蜂场蜂群蜜蜂通过取成年蜂检查蜂螨数量，计算得到蜂螨寄生率在3.68%-8.67%之间，其中，长兴蜂场的平均蜂螨寄生率要高于其它蜂场，但差异不显著(P>0.05，图2)。因在越冬期间蜂群治螨比较彻底，而在3月份取样前，蜂螨数量还未有明显增加，在2020年3月取样的所有蜂群的成年蜂体表均未检查到蜂螨，即所有蜂群的蜂螨寄生率均为零。

图2 各蜂场蜂群蜜蜂的蜂螨寄生率

3.3微孢子虫感染情况 在越冬期(2019年12月)，所有蜂群的微孢子虫孢子数在0-7.0×105个/蜂之间。长兴蜂场的5群蜜蜂均没有观察到微孢子虫感染；萧山蜂场每群蜜蜂的微孢子虫感染情况都比较严重，平均每只蜜蜂体内孢子数达到2.7×105个，显著高于其它蜂场的蜂群(P<0.05)；其余蜂场的蜜蜂体内仅有少量孢子(图3)。而在春季(2020年3月)所有蜂群的微孢子虫孢子数在0-2.3×106个/蜂之间。其中，除了萧山蜂场以外，其它5个蜂场蜜蜂体内微孢子虫数量均有不同程度的上升，尤其是绍兴蜂场平均每只蜜蜂体内孢子数从越冬期的0.2×105个显著上升到春繁期的9.1×105个，显著高于淳安(P<0.05)和萧山(P<0.05)蜂场的蜂群，而其它蜂场间有没有显著区别(P>0.05，图3)。

图3 各种蜂场蜜蜂体内微孢子虫孢子数注：不同字母之间代表差异显著。

3.4病毒感染情况

3.4.1病毒感染率 越冬期(2019年12月)和春繁期(2020年3月)各个种蜂场蜜蜂体内常见的5种蜜蜂病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率如图4所示。在越冬期，各个蜂场均有很高比例的蜂群感染BQCV(60%～100%)、CBPV(80%～100%)和DWV(100%)，而IAPV(20%～80%)和SBV(0～20%)感染比例相对较低。从越冬期到春繁期，整体而言，除了BQCV以外，各个蜂场蜜蜂体内其它4种病毒的感染率呈现一定的下降趋势。其中，在春繁期(2020年3月)，江山蜂场蜜蜂体内IAPV感染率(60%)显著高于千岛湖蜂场(0%，P<0.05)，长兴蜂场蜜蜂体内DWV感染率(100%)显著高于绍兴蜂场(40%，P<0.05)。除此之外，其它各组病毒感染率在越冬期和春繁期并没有显著变化(P>0.05，图4)。

图4 不同取样时间点各种蜂场蜜蜂体内常见病毒感染率注：*代表P<0.05。

图5 不同取样时间点各种蜂场蜜蜂体内常见病毒感染滴度注：不同字母代表不同的显著性水平。

3.4.2病毒感染滴度 对于6家种蜂场蜜蜂体内五种常见病毒感染滴度的测定结果如图5所示。在越冬期(12月13日)，各蜂场蜜蜂体内只有SBV病毒感染滴度存在显著差异，即没有SBV感染的萧山蜂场蜜蜂显著低于其他5家蜂场(均为P<0.001)，兰溪蜂场蜜蜂体内SBV病毒感染滴度也要比淳安(P<0.05)和绍兴(P<0.01)两家蜂场明显更高。而到春繁期(3月11日)，除了江山蜂场蜜蜂体内SBV感染滴度明显较高以外，其他5家蜂场蜜蜂体内的病毒感染滴度已不可检测到，此时，千岛湖蜂场蜜蜂体内IAPV病毒感染滴度也低于检测限，显著低于其他几家蜂场(均为P<0.01)。除此之外，其他病毒的感染滴度在不同时间段内各蜂场间无明显区别(P>0.05，图5)。

总体而言，平均每群蜜蜂体内CBPV病毒感染滴度在3.99-6.19(基因组log拷贝数，下同)之间，并且病毒感染滴度在越冬期和春季产蜜期之间也无明显区别。对于BQCV，平均每群蜜蜂体内病毒感染滴度从越冬期(2.81-3.67)到春繁期(5.17-6.69)显著上升(P<0.001)；而相反地，DWV病毒感染滴度(6.96-8.09)从越冬期到春繁期则呈现显著下降趋势(P<0.001)。此外，和DWV类似，从越冬期到春繁期IAPV(越冬期：2.63-3.29；春繁期： 0.00-1.66，P<0.001)和SBV(越冬期：0.00-6.98，春繁期：0.00-5.47，P<0.001)的病毒感染滴度也均有明显的下降趋势(图5)。

4 讨论

蜜蜂作为社会性昆虫，蜂群整体健康状态与外界环境息息相关，所以在做相关测定时，必须选择一个适宜的地方进行集中测定。本次对蜜蜂抗病力指标的集中测定是近年来全国首次对蜜蜂种质进行的集中对比研究。目前的结果表明6家种蜂场的蜜蜂在微孢子虫和病毒感染等抗病力指标上存在显著差异，而对于蜂螨的寄生并无明显区别。

虽然在进场时，6个蜂场间的蜂群群势差异较大，但在越冬期和春繁期时蜂群在蜂量和子脾数量上趋同(图1)，说明养蜂生产上的饲养管理能对蜂群群势起到决定作用。这也为后续相关抗病力指标的测定提供了参考，由此避免了蜂群群势差异可能对本研究造成的一定影响。

浆蜂蜂螨寄生率主要和蜂群本身的抗螨性及蜂场治螨效果有关。目前浙江省的浆蜂蜂群都不是抗螨蜂种，本次的测定结果也表明不同时期不同种蜂场的蜂群在蜂螨寄生率上无显著差异，显示各蜂场蜜蜂的抗螨能力类似。在蜂种无抗螨性的情况下，蜂群的蜂螨寄生率基本取决于蜂场的治螨效果。在越冬期测得各蜂群的蜂螨寄生率在0-19.44%之间，说明总体来看该时期蜂场治螨效果较佳，但仍有少数蜂群蜂螨寄生率超过了10%，蜂群健康处于明显受威胁的状态，这一点和越冬期间部分蜂群出现死蜂的现象相符。由于蜂螨的生命周期大部分是在蜂群巢房内的繁殖阶段[3,11]，在越冬期无子脾的情况下进行治螨处理效果较好。经历过漫长的冬季待到春繁期时，成年蜂体表已没有蜂螨寄生(图2)，进一步说明越冬期为治螨的关键时期，决定着来年春季蜂群的整体健康态势。

两次的测定结果说明不同种蜂场蜂群感染微孢子虫程度存在显著差异，而在多数蜂场蜂群微孢子虫孢子数不多的情况下，萧山蜂场和绍兴蜂场分别在冬季和春季微孢子虫孢子数明显高于其它种蜂场的蜂群(图3)，说明这两个蜂场蜂群抗微孢子虫能力可能较差。这两家种蜂场在蜂王选种和育王时需更多考虑蜂群感染微孢子虫的情况，逐步改善抗微孢子虫的能力。

在越冬期，各个蜂场均有一定比例的蜂群感染BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV等5种病毒，且其中较高感染比例的病毒为BQCV和DWV(图4)，这与此前国内西方蜜蜂病毒流行性调查结果类似[9,12]。此外，蜂群被多种病毒同时感染是普遍的现象[13]，本研究的结果也是如此。除了江山蜂场蜜蜂体内IAPV感染率显著高于千岛湖蜂场，长兴蜂场蜜蜂体内DWV感染率显著高于绍兴蜂场外，其它各组病毒感染率在越冬期和春繁期并没有显著变化(图4)，这可能与各蜂群成年蜂体表蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力较强有关。整体而言，从越冬期到春繁期，除了BQCV以外，各个蜂场蜜蜂体内其它4种病毒的感染率呈现一定的下降趋势。此前有报道显示微孢子虫与BQCV间具有一定的协同作用[14]，本研究中6家蜂场蜜蜂上微孢子虫孢子数从越冬期到春繁期均有所增加，这可能是为什么BQCV感染率没有随着蜂群中蜂螨寄生率的下降而降低的原因。

从越冬期到春繁期，平均每群蜜蜂体内BQCV病毒感染滴度显著上升；而相反地，DWV、IAPV和SBV病毒感染滴度从越冬期到春繁期则呈现显著下降趋势(图5)。这种趋势与前述病毒侵染率结果类似，也可能与各蜂群在春繁期蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力较强有关。由于蜜蜂病毒与蜂螨间联系紧密[15]，DWV更是已经证明与狄斯瓦螨存在紧密的协同作用[16]，这也进一步解释了为什么不同时期各蜂场间的蜜蜂病毒感染情况(除了BQCV)也基本差别不大，仅在较少的蜂场间存在病毒感染率和病毒感染滴度间的显著差异。

本次测定仅选取了每家蜂场5群蜜蜂，而且在养殖过程中难免会有一些蜂群出现特殊情况(如盗蜂等)影响实验结果。因此，在条件允许的情况下，今后应选取更多的蜂群开展测定。本研究发现各种蜂场蜂群均没有表现出自然抗蜂螨能力，且抗螨能力没有显著差异，且不同种蜂场蜂群感染微孢子虫程度存在显著差异，部分蜂场蜂群感染微孢子虫情况更为严重。此外，各种蜂场蜂群病毒感染情况都比较严重，且抗病毒能力没有显著差异，而这与蜂螨和微孢子虫等寄生虫的感染联系较密切。在今后的蜜蜂饲养管理和蜜蜂育种工作中，有效防控蜂螨和微孢子虫的侵染程度将有助于促进蜂群的抗病毒能力，增加蜂群的整体健康态势。