温针灸对膝骨关节炎大鼠软骨组织ADAMTS-4及MMPs-3的影响

江 润，张 涛，毛 珍，张红星

（1.武汉协和江北医院风湿科，武汉 430100；2.武汉协和江北医院康复疼痛科，武汉 430100；3.湖北中医药大学针灸骨伤学院，武汉 430061）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）是一种临床常见的疾病，以关节软骨、韧带、包膜和肌腱等退化为病理表现[1-2]。本病发病机制复杂，多与遗传、代谢、年龄等因素密切相关[3-4]。研究表明，ADAMTS-4、MMPs-3 为关节软骨外基质的水解酶，参与关节软骨的降解，是关节退化的重要标志[5]。故本次研究拟观察温针灸对膝骨关节炎大鼠关节软骨组织ADAMTS-4、MMPs-3 的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取6～8 周龄雄性SPF 级SD 大鼠（180±20）g，40 只，均购于三峡大学实验动物中心，合格证号SCXK（鄂）2017-0012，喂养于华中科技大学同济医学院动物实验中心SYXK（鄂）2016-0057。饲养于SPF 级动物房，室温20～25 ℃。本次实验由华中科技大学同济医学院动物福利委员会许可。所有动物适应性喂养1 周后，随机分为正常组10 只（不做任何处理），模型组30 只。水合氯醛（国药集团公司，批号：32584210），单碘乙酸盐（北京欧北生物科技有限公司，批号：408251756）；ADAMTS-4 抗体（美国ASPEN 公司，批号：HS-320145），MMPs-3 抗体（武汉三鹰，批号：125847-2-ap）；HRP 标记羊抗兔二抗（上海生工生物有限公司，D110058 ）。华佗牌一次性无菌毫针，规格0.25×25 mm（江苏医疗机械用品有限公司）；艾柱（南阳金堂艾制品有限公司）；自制鼠衣及固定装置；电泳仪（北京市六一仪器厂，型号：DYY-6C）；酶标仪（Diatek 公司，型号：DR-200Bs）；转移电泳仪槽（北京市六一仪器厂，型号：DYCZ-400D）；X 线检测设备（美国ASPEN 公司出厂）。

1.2 动物造模及分组 采用经典KOA动物造模方法，膝关节腔内注射木瓜蛋白酶溶液制备KOA大鼠模型[6]。具体操作：所有大鼠，用10%水合氯醛，0.03 mL/g，腹腔注射麻醉，对大鼠双侧膝关节附近的鼠毛进行清理，将膝关节处于屈曲45°；将4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL 注射到除正常组以外大鼠双侧膝关节腔内，隔日1 次，连续2 周。正常组，以同样的方式，注射9%生理盐水0.1 mL。造模2周后，采用X线进行模型鉴定。

造模成功标志。KOA 大鼠X 线示关节软骨退化，胫骨平台欠光滑，关节间隙变窄，或伴有唇样骨赘。本次实验造模成功26 只，造模成功率86.67%。造模过程中，所有大鼠均正常饮食、自由摄水。将造模成功的大鼠分为模型组（8 只，仅造模），温针灸组（9 只，造模后给予干预），针刺组（9 只，造模后，给予干预）。

1.3 方法 温针灸组大鼠穿上自制鼠衣后，固定在装置上，将双侧膝关节弯曲45°，充分暴露关节腔。参照《实验针灸学》[7]取“后三里”和“膝前穴”。皮肤常规消毒，取0.25×25 mm 针具迅速刺入，刺入深度3～5 mm，停止进针；将艾柱置于针柄，点燃艾柱，燃尽后，换另一壮，每次2 壮，连续治疗10 d。针刺组仅给予针刺，不作艾灸处理，方法同温针灸组。正常组与模型组不做任何处理。

1.4 观察指标

1.4.1 膝关节厚度及被动活动度 关节被动活动度=最大屈曲角度-最大伸展角度。

1.4.2 关节液中IL-6、TNF-α含量 采用ELISA法检测。最后一次治疗后，大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用注射器抽取2 mL 生理盐水注射到大鼠双侧膝关节腔内，被动活动膝关节数次，抽取关节滑液，离心后取上层清液，于-80 ℃冰箱备用。按照ELISA 试剂盒操作说明，检测关节液中IL-6、TNF-α 含量。

1.4.3 软骨组织中ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白含量 采用Western blot 检测法。摘取大鼠双侧膝关节，剥离软骨组织，将软骨组织粉碎；将少量软骨组织加入0.5 mLRIPA 裂解液后，于2 ℃下15 000 r/min 离心10 min，取上清液；用DR-200Bs 酶标仪测定蛋白浓度，对待测蛋白进行上样，依次完成电泳、转膜、封闭及免疫印迹显色等步骤。采用Image J 软件分析条带灰度值。

1.4.4 滑膜组织中ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 表达 取少量滑膜组织于液氮中研磨成粉末，用Trizol试剂提取组织RNA，并测定RNA 浓度；将提取的RNA 样品进行cDNA 合成；将cDNA 样品置于RTPCR 反应体系进行PCR 扩增；以GAPDH 作为内参，选用待测mRNA 相对含量。PCR 引物列表见表1。

表1 引物序列情况

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 22.0软件进行分析，先采用ShaPiro-Wilk 检验法对数据进行正态性检验，若符合正态分布，采用均数±标准差（）表示。多组间比较，采用单因素方差分析，若组间有差异，采用Bonferroni 法进行两两比较；若不符合正态分布，选择Kruskal-Wallis 检验。计数资料，采用卡方检验。

2 结果

2.1 正常组与模型组膝关节X 线检查结果 正常组关节间隙正常，关节软骨厚度适中；模型组关节间隙变窄，伴轻度骨赘，软骨变薄。表明膝骨关节炎模型造模成功。

2.2 各组膝关节厚度及被动活动度 见表2。

表2 各组膝关节厚度及被动活动度比较

2.3 各组大鼠关节液中IL-6、TNF-α 含量 见表3。

表3 各组大鼠关节液中IL-6、TNF-α 含量（）μg/L

表3 各组大鼠关节液中IL-6、TNF-α 含量（）μg/L

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.4 各组大鼠软骨组织中ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表达 见表4、图1。

表4 各组大鼠滑膜组织ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白相对含量（）

表4 各组大鼠滑膜组织ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白相对含量（）

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

图1 各组大鼠滑膜组织ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表达情况

由表4、图1 可知，与正常组比较，造模组ADAMTS-4、MMPs-3 含量升高，P＜0.05；与针刺组比较，温针灸组ADAMTS-4、MMPs-3 含量更低，P＜0.05。

2.5 各组大鼠滑膜组织中ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相对表达 见表5。

表5 各组大鼠滑膜组织ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相对含量（）

表5 各组大鼠滑膜组织ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相对含量（）

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

3 讨论

随着人口老年化趋势，膝骨关节炎的发病率日益增加[8-9]。当前西医对本病多采用药物（非甾体抗炎药）治疗、手术治疗等，但手术疗法容易造成二次损伤，药物服用容易产生依赖性，这些疗法只能暂时缓解患者的症状[10]。温针灸作为祖国医学的特色疗法，将针刺效应与艾灸的温热刺激结合，发挥温通经络，疏通气血之效[11]。大量研究证明，温针灸治疗膝骨关节炎的有效性，但其作用机制尚未完全明确[12-13]。

ADAMTS-4 是一类参与膝关节软骨退化的酶类[14]。研究[15]表明，如果对小鼠ADAMTS-4 基因进行敲除，小鼠膝骨关节炎发病率明显降低。关节软骨受机械摩擦长期刺激，会激活ADAMTS 系统，导致ADAMTS-4 含量增加，从而加速软骨破坏，使软骨变硬变薄。体外软骨细胞培养表明，膝骨关节炎早期ADAMTS-4 是参与聚蛋白多糖酶裂解的主要酶类，给予ADAMTS 抑制剂，聚蛋白多糖降解受到抑制[16]。因此调节ADAMT 活性可以作为防治KOA 的新靶点。MMPs-3 作为MMPS 家族成员，由软骨细胞分泌，存在于软骨细胞外基质，降解蛋白、多糖等物质，参与关节软骨的破坏[17]。研究[18]表明，MMPs-3 并非单一作用，若MMPs-3 含量增多，能激活其他MMPs 成员，产生联合反应，加速关节软骨的破坏，MMPs-3 代谢产物能诱导T 细胞活化，产生多种细胞因子，加重炎症反应。研究[19]表明，在膝骨关节炎不同阶段，关节软骨内的滑膜细胞和软骨细胞存在大量的MMPs，关节软骨的抗应力因此下降，骨代谢异常，诱导软骨细胞发生凋亡，细胞基质加速降解，最终导致关节退变。史广强等[20]研究发现，膝骨关节炎患者血清MMP-3水平均明显高于健康人群，MMPs-3 分泌失衡是引起关节软骨退行性变的主要原因。因此，在KOA 的发病过程中，MMPs-3 是促进关节滑膜炎症、关节软骨降解最重要的酶，也是反映关节软骨退变程度的重要标志物。IL-6、TNF-α 为一类促炎性细胞因子，能介导免疫和炎症反应，能诱导滑膜细胞、软骨细胞分泌ADAMTS-4、MMPs-3，从而增强炎症反应，加速软骨退化[21]。本次研究中，温针灸组KOA 大鼠关节炎中IL-6、TNF-α 含量均低于造模组，表明温针灸能减轻KOA 大鼠关节液中的炎性反应。在滑膜组织中，温针灸组大鼠ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表达及mRNA 相对含量均低于造模组、针刺组。由此可知，温针灸对KOA 大鼠的作用机制可能是通过抑制ADAMTS-4、MMPs-3 表达减轻炎症反应，从而减少膝关节厚度，增大膝关节被动活动度。