LncRNA PANDAR、miR-637表达与甲状腺癌临床病理参数及预后的关系

敖雪仁 廖 聪 马凯敏 沈国喜

广州中医药大学第三附属医院外科，广东广州 510385

甲状腺癌来源于甲状腺上皮细胞，是内分泌系统常见的恶性肿瘤之一[1-2]。全球癌症数据统计显示，2018 年全球甲状腺癌的诊断患者约占全部癌症的3.2%[3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）PANDAR 是一种新型LncRNA，在多种癌症中均有高表达，如舌鳞状细胞癌、胃癌等[4-5]。有研究显示，LncRNA PANDAR 在人类癌症的发生发展中具有重要的作用，具有多种生物学功能，如调节细胞凋亡及侵袭、诱导多功能干细胞基因再编辑等[6]。微小RNA（microRNA，miRNA）具有多种生物学功能，如与靶基因mRNA 互补结合进而抑制其基因转录及蛋白质翻译，进而在癌症的发生发展中发挥重要作用，如促进癌细胞的增殖、分化、侵袭及上皮-间质转化等过程[7]。miR-637 在多种肿瘤组织中均表达下调，如神经胶质瘤、肝癌等[8-9]，可抑制癌细胞的生长，具有一定抑癌作用。因此，本研究分析两个指标在甲状腺癌中的表达及其与患者临床特征及预后的关系，为患者治疗提供新的科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月至2017 年2 月于广州中医药大学第三附属医院住院治疗的甲状腺癌患者82例。纳入标准：①病理诊断甲状腺癌；②首次患病；③临床病理资料完整并接受随访，且签署知情同意书。排除标准：①患有同系统其他相关疾病，如甲状腺功能减退症等；②患有重要脏器疾病，如冠心病等；③患有其他恶性肿瘤。

1.2 研究方法

收集术中获取的甲状腺癌组织及癌旁正常组织（距肿瘤组织边缘超过5 cm，经病理证实），冷冻保存并立即送检。取100 mg 组织标本，应用TRIzol 法提取总RNA（试剂盒购于Biosharp 公司，货号：20160911），使用紫外分光光度仪检测RNA 浓度，符合标准的RNA 冻存备用。使用RNA 逆转录试剂盒（购于日本TaKaRa 公司，货号：20141112）将提取出的RNA 进行反转录成cDNA，反应体系：Enzyme Mix 1 μl、5×RT Buffer 4 μl、Primer Mix 4 μl、ddH2O 11 μl，共20 μl 体系；反应条件：37℃60 min，90℃30 s。以cDNA 为模板，使用PCR 扩增试剂盒（购于苏州泓迅生物科技股份有限公司，货号：20151107）进行PCR 扩增，所有引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，LncRNA PANDAR 正向引物：5’-CTGTTAAGGTGGTGGCATTG-3’，反向引物：5’-GGAGGCTCATACTGGCTGAT-3’；内参GAPDH 正向引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-637 正向引物：5’-AGCCCACACACTACAGGCA-3’，反向引物：5’-GCACAAAAGCAGTACGACCT-3’；内参U6 正向引物：5’-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3’，反向引物：5’-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3’；反应体系：10 μl 2×SYBR Green，1 μl 20×TaqDNA 聚合酶，上下游引物各0.5 μl和8 μl ddH2O。qPCR 反应条件：95℃预变性5 min，55℃变性1 min，72℃延伸10 s，共40 个循环。最后结果以2-ΔΔCt来计算和标准化LncRNA PANDAR 与miR-637的相对表达量。

1.3 观察指标

比较甲状腺癌组织与癌旁正常组织中LncRNA PANDAR 与miR-637的表达，分析二者间的相关性；分析甲状腺癌组织中LncRNA PANDAR 与miR-637与临床病理特征的关系；以LncRNA PANDAR的表达中位数3.24 为临界值，分为LncRNA PANDAR 高表达组43例，LncRNA PANDAR 低表达组39例，以miR-637的表达中位数5.13 为临界值，分为miR-637高表达组44例和miR-637 低表达组38例，从患者出院日起，每1～3 个月随访1 次，包括门诊或电话两种随访方式，随访时间为3～36 个月，随访至终止时间或患者死亡，随访时间截止至2020 年2 月。比较高、低表达组患者预后3 年生存率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 线性相关分析，采用Kaplan-Meier检验分析LncRNA PANDAR、miR-637 与患者预后的关系。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA PANDAR 与miR-637的表达及相关性分析

甲状腺癌组织中LncRNA PANDAR的相对表达量高于癌旁组织，miR-637的相对表达量低于癌旁组织（P ＜0.05）。见表1。Pearson 相关分析结果显示，LncRNA PANDAR 与miR-637的表达呈负相关（r=-0.634，P ＜0.05）。见表1。

表1 癌组织及癌旁组织LncRNA PANDAR与miR-637的相对表达量比较（±s）

表1 癌组织及癌旁组织LncRNA PANDAR与miR-637的相对表达量比较（±s）

注：LncRNA：长链非编码RNA；miR-637：微小RNA-637

2.2 甲状腺癌组织中LncRNA PANDAR 及miR-637与临床参数的关系

甲状腺癌组织中LncRNA PANDAR、miR-637的表达与肿瘤TNM 分期、淋巴转移、细胞分化程度有关（P ＜0.05），与患者性别、年龄、病理类型、病灶特点及肿瘤直径无关（P ＞0.05）。见表2。

表2 甲状腺组织中LncRNA PANDAR 及miR-637与临床参考的关系（±s）

表2 甲状腺组织中LncRNA PANDAR 及miR-637与临床参考的关系（±s）

注：LncRNA：长链非编码RNA；miR-637：微小RNA-637

2.3 LncRNA PANDAR、miR-637表达与患者预后的关系

82例甲状腺癌患者均随访成功，无失访患者。随访3 年内，共有16例患者死亡。LncRNA PANDAR 高表达组3 年总体生存率（overall survival，OS）为69.77%（30/43），LncRNA PANDAR 低表达组3 年OS 为92.31%（36/39），Kaplan-Meier 分析显示，LncRNA PANDAR高表达组3 年OS 低于LncRNA PANDAR 低表达组（χ2=5.726，P=0.032）。miR-637 高表达组3 年OS为86.36%（38/44），miR-637 低表达组3 年OS 为73.68%（28/38），Kaplan-Meier 分析显示，两组患者3 年生存率比较，差异无统计学意义（χ2=3.710，P=0.059）。见图1。

图1 不同表达LncRNA PANDAR、miR-637 患者3 年生存率

3 讨论

LncRNA 是一个长度约为200 个核苷酸的非编码RNA的转录本[10-11]。最近的研究显示，LncRNA 在多种癌症的发生发展中起着重要作用，如胃癌、乳腺癌等[12-13]，通过影响、调节细胞生长过程，参与肿瘤的发生发展。LncRNA PANDAR 是CDKN1A 反义DNA 损伤激活RNA的启动子，染色体位置为6p21.2，是近些年来的研究热点。有研究显示，乳腺癌组织中LncRNA PANDAR表达上调，其可通过促进p16（INK4A）的表达进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移等过程的发生[14]。同时，LncRNA PANDAR 在膀胱癌组织中也呈高表达状态，且LncRNA PANDAR的上调与肿瘤分期、淋巴转移及不良预后相关[15]。本研究显示，LncRNA PANDAR 在甲状腺癌组织中表达上调，并且LncRNA PANDAR表达与甲状腺癌患者TNM 分期、淋巴结转移、细胞分化程度相关，提示LncRNA PANDAR 可能参与了甲状腺癌的发生发展。LncRNA PANDAR 可通过上调波形蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的表达，下调E-钙黏蛋白表达来促进上皮间质转化过程，进而提升肿瘤细胞的侵袭及转移能力，促进了肿瘤组织的发生发展[16-17]。此外，LncRNA PANDAR 还可以激活肿瘤发生发展的重要分子信号通路PI3K/AKT，上调PI3K的表达，刺激肿瘤细胞的生长，上调B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，减少肿瘤细胞的凋亡数量，促进肿瘤细胞的增殖及分化，提高肿瘤细胞的恶性程度，进而影响甲状腺癌的进展[18]。

miRNA 是一种长度约为20 个核苷酸的非编码RNA，可以与靶基因mRNA的3’UTR 区结合，影响靶基因的转录及翻译过程，进而参与细胞生理过程[19-20]。异常表达的miRNA 可影响多种生物学过程，如表达异常的miRNA 可以以原癌基因的形式促进肿瘤的形成[21]。miR-637 是较早发现的miRNA 之一，位于染色体19p13.3，在癌症的发生发展中发挥重要作用，如miR-637 可通过抑制转录激活因子3 进而抑制肝癌的发生发展[22]。本研究结果显示，miR-637 在甲状腺癌组织中表达降低，并与细胞分化程度、淋巴结转移、肿瘤TNM 分期相关，初步显示miR-637 在甲状腺癌细胞增殖、分化病理过程中发挥作用。AKT1 是P13K/Akt 信号通路中的上游蛋白，其磷酸化过程激活了该通路并调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。已有研究证实，miR-637 可直接与AKT1的3’-UTR 结合，介导AKT1的降解并下调其表达水平，进而抑制转录因子Foxo1、细胞周期蛋白D1的表达，最终抑制了肿瘤细胞生长过程，抑制了肿瘤的恶性进展[23]。此外，miR-637 还可抑制Bcl-2 并上调促凋亡因子Bax的表达，提示其亦具有促进肿瘤细胞凋亡的功能，有显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及向周围组织转移的能力[24-25]。

Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，LncRNA PANDAR 低表达组术后3 年生存率高于LncRNA PANDAR 高表达组，而不同表达水平的miR-637 对患者术后3 年生存率无明显影响。初步证实了LncRNA PANDAR 与甲状腺癌患者术后不良预后相关，具有作为预测甲状腺癌患者预后的潜能。本研究结果还显示，LncRNA PANDAR 与miR-637 呈负相关，LncRNA PANDAR 可激活信号通路PI3K/AKT，上调PI3K 及AKT的表达，从而对肿瘤的发展起到了促进作用[18]，而miR-637 却可抑制PI3K/AKT 通路中的蛋白AKT1的表达，提示miR-637 对PI3K/AKT 信号通路亦具有一定的抑制作用[23]，抑制肿瘤细胞的增殖及分化过程，因此推测LncRNA PANDAR 与miR-637 具有负相关性，但是具体的作用机制还需在后续细胞水平进行验证。

综上所述，甲状腺癌组织中LncRNA PANDAR呈高表达、miR-637 呈低表达，与细胞分化程度、肿瘤TNM 分期及淋巴转移有关，检测两个指标的表达有助于甲状腺癌患者病情的判断。