Ⅲ型纤连蛋白样包含结构域1 蛋白在食管癌组织中的表达及临床意义

袁庆锋 张 琪 杨云杰

四川省巴中市中心医院胸心外科，四川巴中 636000

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。我国是食管癌高发的国家之一，每年新发病例达24.6 万例，发病率为17.9/10 万，死亡率为13.7/10 万[1]。目前食管癌的治疗包括手术、放化疗等，但部分患者即使经积极治疗后，仍易出现肿瘤复发、转移等恶性进展[2]。Ⅲ型纤连蛋白样包含结构域1（Ⅲtype fibronectin like inclusion domain 1，FNDC1）基因位于6q25.3，属于纤连蛋白家族成员，在表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子信号传导中发挥重要的作用[3]。研究表明，FNDC1 在高血压[4]、心肌梗死[5]及肿瘤[6]等疾病中发挥重要的生物学调控作用，其可以通过促进下游基因的高甲基化促进细胞迁移和增殖等生物学行为，影响疾病的发生发展。最近的一项研究[7]发现FNDC1 在食管癌细胞系中表达较高，过表达FNDC1 后能够促进肿瘤细胞的增殖及迁移。本研究通过分析食管癌中FNDC1的表达及临床意义，为发现潜在的食管癌肿瘤标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013 年4 月至2015 年4 月四川省巴中市中心医院（以下简称“我院”）诊治的食管癌患者93例。纳入标准：①均为初次诊治；②根据病理学检查明确诊断，由2 位病理医师共同阅片。排除标准：①合并食管狭窄、反流性食管炎及食管结核等食管良性疾病；②合并严重心肺肝肾等脏器功能障碍；③合并类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病；④既往有恶性肿瘤病史及治疗史。本研究均经患者知情同意并签署知情同意书，本研究已经我院医学伦理委员会审核批准通过。所有食管癌患者自确诊之日起开始随访，以电话方式，每3 个月随访1 次，随访5 年，随访内容为患者生存情况。随访截止至2020 年5 月，随访终点为患者复发或随访结束。

1.2 荧光定量PCR 检测组织中FNDC1的表达

应用Trizol 法提取组织中总RNA，Narodrop 检测RNA的浓度和纯度。将总RNA 反转录合成cDNA，-20℃保存。反转录试剂盒购自北京天根公司，货号：KR123。反应体系：SYBR Green premix 10 μl，正向及反向引物各1 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 7 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 个循环。FNDC1的正向引物序列：5’-GCCAAGGCATGTGAAACTG-3’，反向引物序列：5’-CTGGTAGCATCTTTGGGTGGG-3’，以GAPDH 为内参，GAPDH正向引物序列5’-ACCCAAAGAT-GCTACCAGTAGA-3’，反向引物序列：5’-AGCAGCA-CAAAGTACACTACC-3’。采用2-△Ct法表示组织中FNDC1的相对表达量。

1.3 免疫组化检测组织中FNDC1 蛋白表达

将组织用10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，厚度4 μm，二甲苯脱蜡；梯度水化；高压锅柠檬酸缓冲液抗原热修复；3%双氧水去除内源性过氧化物酶；5%羊血清，室温封闭30 min；一抗4℃孵育过夜（FNDC1 稀释比1∶200，购自abcam 公司，货号：174833）；二抗，室温2 h；DAB 显色3 min；苏木精染核30 s（小鼠/兔超敏聚合物法检测二步法通用试剂盒购自北京中衫金桥公司，货号：PV-8000）；梯度脱水后封片镜检。染色结果结合高倍镜视野（200×）下染色强度评估，不着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色颗粒为2 分，棕黄色为3 分。每个标本取5 个视野，结果取平均值。0～1 分判定为染色阴性，2～3 分为染色阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验；计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，多组间比较采用R×C 列表χ2检验。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 检验）食管癌组织中不同FNDC1表达的预后生存差异。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌及癌旁组织中FNDC1 mRNA表达比较

食管癌组织中FNDC1 mRNA的相对表达量为（2.12±0.35），癌旁组织中的相对表达量为（1.04±0.20）。癌组织中FNDC1 mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织（t=25.837，P=0.000）。

2.2 食管癌及癌旁组织中FNDC1 蛋白表达比较

FNDC1 阳性棕褐色染色主要位于癌组织中肿瘤细胞的细胞浆。肿瘤组织中FNDC1 蛋白的阳性表达率为66.7%（62/93），癌旁组织中为10.8%（10/93）。癌组织中FNDC1 蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织（χ2=61.275，P=0.000）。见图1（封四）。

图1 免疫组化检测食管癌及癌旁组织中FNDC1蛋白表达(200x)

2.3 癌组织中FNDC1的表达与临床病理特点的关系

癌组织中FNDC1的表达与肿瘤分期、淋巴结转移有关联（均P ＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置及病理分级无关联（均P ＞0.05）。见表2。

表2 癌组织中FNDC1表达与临床病理特征的关系[例（%）]

2.4 癌组织中FNDC1的表达与临床预后的关系

本研究中，93 食管癌患者随访3～60 个月，平均随访时间（26.1±11.2）个月，随访期间死亡74例，存活19例，期间无失访病例。5 年总体生存率（OS）为20.4%（19/93）。FNDC1 阳性和阴性患者的5 年OS 分别为6.5%（4/62）、48.4%（15/31）。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 检验）结果FNDC1 阳性患者5 年OS显著低于阴性患者（χ2=4.557，P=0.032），FNDC1 阳性平均生存时间为（18.4±5.7）个月，而FNDC1 阴性患者平均生存时间为（29.6±6.2）个月，FNDC1 阳性患者的平均生存时间显著短于FNDC1 阴性患者（t=8.675，P <0.001）。见图2。

图2 癌组织中FNDC1的表达与临床预后的关系

3 讨论

食管癌是癌症相关死亡的第六大原因，世界范围内每年新确诊患者例数达45 万，其发病率呈不断增加的趋势，严重威胁人类健康[8-11]。部分患者发现时已处于晚期，丧失手术最佳治疗时机，预后不佳[12-15]。因此有必要深入研究食管癌疾病发生发展的分子机制。食管癌发生的危险因素包括种族、饮食、饮酒、遗传易感性等，特别是环境因素导致的遗传学改变、表观遗传学改变是食管癌发生发展过程中重要的机制。

FNDC1 属于FNDC 家族成员，研究发现，FNDC1参与组织发育、细胞黏附、迁移和增殖等生物学过程[16-17]。有学者报道，在肺动脉高压、恶性肿瘤等多种疾病中，FNDC1 能够激活细胞表面受体G 蛋白信号传导8（AGS8），促进细胞的增殖、抑制凋亡，进而导致疾病的发生发展[18-19]。本研究中，食管癌癌组织中FNDC1 mRNA的相对表达量及FNDC1 蛋白表达阳性率均显著高于癌旁组织。目前食管癌中FNDC1表达上调的机制尚不清楚。分析其可能机制，一方面与FNDC1 受微小RNA（miRNA）的转录后调控有关[20-21]。有研究报道，miR-1207-3p 能够结合FNDC1 mRNA的3’端非编码区，降低FNDC1 mRNA的稳定性，抑制FNDC1的表达，而肿瘤中miR-1207-3p表达下调，导致FNDC1的表达水平升高。另一方面，肿瘤微环境中转化生长因子β表达水平升高能够激活皮质类固醇受体，进而促进肿瘤细胞FNDC1的表达[22]。本研究中，癌组织中FNDC1的表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关，提示FNDC1的表达促进食管癌的发生发展。其机制与FNDC1 参与表皮生长因子（vascular epidermal growth factor，VEGF）介导的血管及淋巴管生成中的重要作用有关。有研究报道，FNDC1 能够激活细胞表面受体AGS8，调节血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的亚细胞分布，促进VEGF-A 诱导的血管内皮细胞信号传导与血管内皮细胞的生长，促进肿瘤血管生成，导致肿瘤分期升高[18]。此外，FNDC1 激活AGS8 后，参与肿瘤细胞中VEGF-C的表达，VEGF-C 通过促进淋巴管内皮细胞中蛋白激酶B的磷酸化，刺激淋巴管内皮细胞的增殖和淋巴管形成，进而促进肿瘤的淋巴管转移[23]。以往研究发现，肿瘤组织中FNDC1的表达与肿瘤患者的生存预后关系密切，其表达水平有助于预测患者的生存预后情况[24]。因此，为进一步分析食管癌中FNDC1表达的预后价值，结果发现FNDC1阳性表达的食管癌患者5 年OS 及平均生存时间均较阴性表达患者明显缩短，提示食管癌组织中FNDC1的表达有助于预测食管癌患者的生存预后，有可能成为判断食管癌患者预后的肿瘤标志物。以往有学者在胃癌中亦发现，高表达FNDC1的患者生存预后较差，其原因是FNDC1表达水平的升高会促进肿瘤细胞的增殖及迁移等恶性生物学行为，促进肿瘤的恶性进展低[25]，患者对治疗的反应差，导致预后不佳[26-27]。

综上所述，食管癌组织中FNDC1表达上调，食管癌中FNDC1的表达与肿瘤分期、淋巴结转移有关，并且FNDC1的表达与患者的不良生存预后有关，有望成为新的判断食管癌预后的肿瘤标志物及潜在治疗靶标。